口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL₂₁ (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达

对杆状病毒BactoBac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造,即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽S转移酶（glutathioneStransferase, GST）基因,构建GST融合表达转座质粒pFGST。通过转座和转染Sf9细胞,证实该系统能高水平表达GST。采用PCR方法从pMTgp51质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株ORF5基因,并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中,使之与GST融合,构建的重组转座质粒pFGST53转染DH10Bac,提取大分子Bacmid DNA,转染Sf9细胞,获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST53。rvGST53感染Sf9细胞,SDSPAGE和Western印迹分析表明：与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达,表达产物分子量为45kD,能与抗PRRSV E蛋白单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物免疫小白鼠,经间接免疫荧光检测,免疫血清能使PRRSV YA株感染的MARC145细胞呈较强的荧光着色,证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性。     

CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (Cowpea Trypsin Inhibitor) 基因 (CpTI) 因其抗虫谱广及不易耐受等优点在植物基因工程中得到广泛应用。为进行遗传修饰食品（Genetically modified foods, GMF）中所含CpTI基因表达产物的安全性评价,我们需要在体外微生物体系中获得大量的CpTI蛋白。采用pGEX融合蛋白表达系统,将CpTI与GST的编码序列在大肠杆菌BL21中进行融合表达,表达产物达到菌体总蛋白的40%。经一步Glutathione Sephrose 4B亲和纯化,融合蛋白GSTCpTI纯度达到90％以上。将Thrombin蛋白酶与融合蛋白过夜作用,可获得切掉了GST标签的CpTI蛋白。活性测定显示GSTCpTI及CpTI蛋白均具有明显的胰蛋白酶抑制剂活性。用纯化的融合蛋白免疫家兔还可诱导产生高效价的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1∶20000。Western Blotting 实验显示,无论是菌体超声裂解后总蛋白中的CpTI蛋白或是经纯化后的CpTI蛋白均可与自制的抗体发生特异性结合。这为进一步进行CpTI蛋白的安全性评价工作奠定了良好基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD2株ORF5/ORF6双基因真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达

为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获得具稳定表达的细胞株。以RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明:RT-PCR检测到两种目的基因的转录;SDS-PAGE和West-ern blot检测到同时表达的两种目的蛋白;间接免疫荧光检测到目的蛋白得到表达。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST₁突变基因和LT_B基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST₁-LT_B融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5）。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST₁-LT_B融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白能够被ST₁单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST₁肠毒素的活性。免疫实验结果表明,K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST₁肠毒素的毒性作用,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。     

A组轮状病毒VP6与霍乱毒素B亚基融合蛋白在大肠杆菌中的表达及生物活性分析

利用霍乱毒素B亚基 (CholeratoxinBsubunit,CTB)的免疫载体作用 ,将轮状病毒相关抗原引入口服免疫体系 ,可激起有效的粘膜免疫反应 ,这里报道了CTB基因与A组轮状病毒地方株T114VP6全基因的融合 ,并在大肠杆菌BL21(DE3 )中进行了融合蛋白的表达。在IPTG诱导下得到分子量为 5 6kD的融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的15 %。分别用抗CT的抗体和抗A组轮状病毒的高价免疫血清进行WesternBlot检测 ,结果证明融合蛋白CTB VP6保留了天然霍乱毒素B亚基及轮状病毒VP6的抗原性。G_M1-ELISA检测表明 ,复性后的融合蛋白具有与神经节苷脂GM1 结合的能力。     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究

为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6。转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体。将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCI-ORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时最高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据。     

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100的构建及应用

利用分子生物学方法,构建了大肠杆菌分枝杆菌(E.coliMycobacterium)穿梭表达质粒pBCG-2100,研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽S转移酶(Glutathione Stransferase,GST)抗原基因在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)中的表达。以含人结核杆菌热休克蛋白(Heat shock protein,hsp)70基因全长序列的质粒pMT-70为模板,扩增出hsp70启动子,测序选出无错配的启动子,将其定向克隆入E.coliMycobacterium穿梭质粒pBCG-2000中,构建成E.coliMycobacterium穿梭表达质粒pBCG-2100。再将编码GST的cDNA按正确的阅读框顺序,克隆到pBCG-2100中hsp70启动子的下游,得到分枝杆菌表达质粒pBCG-GST。将pBCG-GST电转化入BCG中,筛选出重组BCG疫苗,经热诱导后所表达的重组GST(rGST)抗原,为可溶性蛋白,经纯化后,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带,其表达量占BCG菌体总蛋白的13%。Western blot提示rGST能与抗GST的抗体反应。     

牛疱疹病毒Ⅰ型VP22和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合基因DNA疫苗的免疫效应

为了提高表达GP5的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）DNA疫苗的免疫效应,将具有蛋白转导功能的牛疱疹病毒1型（BHV-1）VP22基因插入到经过修饰具有更好免疫原性的PRRSV修饰型ORF5基因（ORF5M）上游,构建VP22和ORF5M融合表达的真核表达质粒pCI-VP22-ORF5M。经间接免疫荧光试验（IFA）和Westernblot检测证实体外表达后,免疫BALB/c小鼠,检测小鼠免疫后的GP5特异性ELISA抗体、抗PRRSV中和抗体和脾淋巴细胞增殖反应,并与非融合的真核表达质粒pCI-ORF5M进行比较。结果显示,融合表达VP22-GP5的DNA疫苗 pCI-VP22ORF5M诱导的体液免疫和细胞免疫反应均明显高于非融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5M,表明蛋白转导相关蛋白BHV-1 VP22能显著增强表达GP5的PRRSV DNA 疫苗的免疫效应,有效发挥了基因免疫佐剂效应;这为研制PRRSV高效DNA疫苗奠定了基础,同时也为其它疾病的高效新型疫苗研究提供了思路。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS-PAGE蛋白电泳表明在39.9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以 Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该399kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36.9 kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为疫苗的候选成份提供理论基础。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Western blot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDV VP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA（国标试剂盒）的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定

应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株S1毒株的GP5基因序列,然后通过KpnI和XhoI酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所克隆入的基因以正确的阅读框插入。获得的重组穿梭载体经线性化后与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183菌株。纯化的重组腺病毒质粒经酶切线性化后转染293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒经纯化后进行RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,证明了用PRRSVGP5蛋白基因所构建的重组腺病毒成功的表达了GP5蛋白。猪体免疫试验后收集血清进行中和实验证明所构建的重组腺病毒在猪体内能够诱导产生中和抗体,因此我们所构建的重组腺病毒可以作为PRRSV基因工程疫苗研究候选病毒株。     

Recombinant Encephalomyocarditis Viruses Elicit Neutralizing Antibodies against PRRSV and CSFV in Mice

Encephalomyocarditis virus (EMCV) is capable of infecting a wide range of species and the infection can cause myocarditis and reproductive failure in pigs as well as febrile illness in human beings. In this study, we introduced the entire ORF5 of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) or the neutralization epitope regions in the E2 gene of the classical swine fever virus (CSFV), into the genome of a stably attenuated EMCV strain, T1100I. The resultant viable recombinant viruses, CvBJC3m/I-ΔGP5 and CvBJC3m/I-E2, respectively expressed partial PRRSV envelope protein GP5 or CSFV neutralization epitope A1A2 along with EMCV proteins. These heterologous proteins fused to the N-terminal of the nonstructural leader protein could be recognized by anti-GP5 or anti-E2 antibody. We also tested the immunogenicity of these fusion proteins by immunizing BALB/c mice with the recombinant viruses. The immunized animals elicited neutralizing antibodies against PRRSV and CSFV. Our results suggest that EMCV can be engineered as an expression vector and serve as a tool in the development of novel live vaccines in various animal species.     

Ubiquitin基因介导下的PRRSV GP5基因免疫特性研究

目的：探讨泛素基因对GP5基因免疫的影响。泛素-蛋白酶体途径是一种高效蛋白降解途径,主要负责真核细胞内蛋白选择性降解。方法：本研究将ORF5DNA片段克隆到含泛素（Ub）基因的表达载体pCMV-Ub和pCMV载体,构建成重组质粒pCMV—Ub-GP5和pCMV-GP5。两种质粒DNA肌肉注射免疫BALb／c小鼠后,分别检测体液免疫反应和细胞免疫反应,比较GP5单基因和Ub—GP5融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果：二者均可诱生PRRSVELISA抗体和中和抗体,其抗体水平无明显差别,但Ub-GP5融合基因诱生的淋巴细胞反应和CTL反应明显高于GP5基因。结论：泛素基因可以促进GP5诱生细胞免疫反应。     

单纯疱疹病毒2gD-Hsp70融合蛋白基因的构建及表达

构建并原核表达Hsp70-HSV2gD融合蛋白。将Hsp70和HSV-2gD蛋白基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建成重组质粒pGEX-4T-Hsp70-gD,并测序鉴定。重组质粒pGEX-4T-Hsp70-gD转化大肠杆菌DH5α后,IPTG诱导表达并进行SDS-PAGE分析。表达产物纯化后做Westernblot检测。将其肌注免疫BALB/c小鼠,检测融合蛋白对免疫小鼠脾淋巴细胞增殖、γ-干扰素产生以及血清中gDIgG水平的影响。表达产物的SDS-PAGE分析发现,在相对分子量为118kD处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。用GST柱得到了纯化的Hsp70-HSV2gD融合蛋白。Westernblot证实,表达产物具有良好的活性。GST-Hsp70-gD组蛋白疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数和脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素的水平高于其它组(P<0.05)。血清单纯疱疹病毒-2gD蛋白的抗体水平高于其它组(P<0.05)。     

体外共表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白可形成异源二聚体

为了探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因编码的GP5蛋白和ORF6编码的M蛋白体外共表达特性,分别构建了PRRSV ORF5、ORF6单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5、pCI-ORF6和pCI-ORF5/ORF6,转染BHK-21细胞,Western blot检测证实共表达的GP5和M蛋白能够形成异源二聚体。同时,以绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)为示踪,发现当ORF5-EGFP和ORF6-RFP共表达时,能促进GP5蛋白从内质网向高尔基体转运,提示GP5-M异源二聚体的形成可能与GP5蛋白的翻译后修饰、转运、定位有关。     

人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 ,为下阶段深入AWP1功能研究提供了重要的基础     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株GP3蛋白的原核表达与纯化

利用限制性酶切从重组质粒pRSET-GP3中得到缺失N端疏水序列的基因片段tGP3(truncated GP3)。将tGP3克隆至原核高效表达载体pRSET,在E.coliBL21细胞中用IPTG诱导表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白(His)6-GP3,并用亲和层析法获得了纯化蛋白。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,从而为进一步研究PRRSV GP3结构蛋白的免疫特性和功能奠定了基础。