植物细胞表面蛋白的研究 Ⅲ 烟草细胞表面蛋白的组分

用有机溶剂CM、Tris-HCl缓冲(pH7.5)的生理盐水(TS)和稀碱(AS)溶液分类分离烟草细胞表面蛋白,发现含有10％左右的CM蛋白,30％左右的TS蛋白,60％左右的AS蛋白和一些未经鉴定的碱不溶性物质(AIS)。 CM蛋白的紫外吸收光谱分析,在波长260 nm附近有一吸收峰,波长320 nm处有一个肩,Sephadex LH-20亲脂性柱层析可分离出四个组分,按其光谱特性可分成两大类。TS蛋白主要是一些水解酶,已测出的有过氧化物酶,酯酶、磷酸酶和腺甙三磷酸酶。AS蛋白在Sepharose 4B柱上可分离出两个洗脱峰,SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结果表明,主带分子量接近1.5×10~5道尔顿。 显微镜下观察TCSP及其用CM、TS和AS相继提取后的残存物形态,看到悬浮在无离子水中的TCSP表面密布黄色球形颗粒。CM提取后颗粒消失,出现比较平滑的表面。TS提取后残存物表面出现纹理结构和丝状物。AS提取后剩下的是一束束解开的纤维状物质。     

植物细胞表面蛋白的研究——Ⅳ 烟草细胞表面蛋白的盐溶性组分是部分质膜蛋白组分的外延

用EDTA和某些去垢剂在有0.15MNaCl存在的条件下提取烟草细胞表面蛋白,认为含有5％正丁醇、10 mM Tris-HC1、0.15 MNaCl和0.1mM EDTA的溶液(pH 7.5,B-TBSE)是比SDS-TBSE更为理想的溶剂。过氧化物酶、酯酶、磷酸酶和ATP酶可直接进行测定。溶液中亚丁醇和EDTA的浓度对ATP酶无明显的抑制作用。 TCSP中的盐溶性组分(TSP)可以用生理盐水直接从细胞表面洗脱。质壁分离时TSP大部分都吸附在墨表面,休克时有过氧化物酶和部分ATP酶释放出来。在高渗条件下吸附在壁表面的酶,大部分部可用1％胆酸钠增溶。除上述盐水可洗脱的酶以外,细胞壁中尚有一部分可用1％Triton X-100、1 MNaC1洗脱的和碱溶性的蛋白(ASP)结合的过氧化物酶。当细胞由对数生长期中期进入后期时,TSP的过氧化物酶活性增加而酯酶活性下降。实验表明TSP是部分质膜蛋白组分的外延。 1 mMEDTA、5 mMMgCl_2或含有1mMEDTA的5％正丁醇都不能从细胞表面洗下ATP酶。但预先用E DTA、MgCl_2或含有EDTA的正丁醇洗涤细胞,则可阻碍或促进ATP酶的分离。而且EDTA的阻碍作用可被MgCl_2抵消。     

膜蛋白嵌入脂质体的研究 Ⅵ.金属离子对猪心线粒体细胞色素氧化酶在脂质体重组的影响

用胆酸盐增溶和硫酸铵分级沉淀方法从猪心线粒体分离得到光谱鉴定较纯的细胞色素氧化酶。酶由8个亚基组成,在低浓度去垢剂环境中以二聚体或四聚体存在,分子量分别为270,000和540,000。通过胆酸盐透析法将细胞色素氧化酶组装到大豆磷脂制备的脂质体上,研究了重组过程中蛋白/磷脂比例,介质pH范围等条件,从而使所得脂酶体活力较高,呼吸控制率达2～3。在透析过程中Mg~(2 )的存在能明显改善重组效果,使呼吸控制率与对照相比增加100%左右。也比较了其他金属离子的影响。在相同浓度下,二价金属离子促进作用的顺序为:Ca~(2 )>Mg~(2 )>Mn~(2 )。对金属离子的作用机理进行了探讨。     

膜蛋白嵌入脂质体的研究——Ⅵ.金属离子对猪心线粒体细胞色素氧化酶在脂质体重组的影响

用胆酸盐增溶和硫酸铵分级沉淀方法从猪心线粒体分离得到光谱鉴定较纯的细胞色素氧化酶。酶由8个亚基组成,在低浓度去垢剂环境中以二聚体或四聚体存在,分子量分别为270,000和540,000。通过胆酸盐透析法将细胞色素氧化酶组装到大豆磷脂制备的脂质体上,研究了重组过程中蛋白/磷脂比例,介质pH范围等条件,从而使所得脂酶体活力较高,呼吸控制率达2～3。在透析过程中Mg~(2 )的存在能明显改善重组效果,使呼吸控制率与对照相比增加100%左右。也比较了其他金属离子的影响。在相同浓度下,二价金属离子促进作用的顺序为:Ca~(2 )>Mg~(2 )>Mn~(2 )。对金属离子的作用机理进行了探讨。     

金属螯合亲和层析纯化金属硫蛋白

将二价铜离子螯合在Chelating Sepharose Fast Flow凝胶上制成亲和层析柱,锌诱导兔肝和镉诱导小鼠肝经匀浆、乙醇处理后上柱,用pH4.0的醋酸盐缓冲液平衡,再用pH5.2不同浓度的醋酸盐缓冲液分别洗脱,可得两个金属硫蛋白(MT)洗脱峰,经确定先后为MT-2和MT-1.分离方法比传统的凝胶过滤-离子交换法简单、省时,适于实验室规模分离纯化.     

抗生素4-215的分离、提纯和鉴定

抗生素4一215是由诺卡氏菌4-215产生的。它对水稻白叶枯有显著疗效。抗生素4-215是两性的无色柱状结晶。易溶于酸和碱,稍溶于甲醇和乙醇,但不溶于丙酮和其他有机溶剂。茚三酮。三氯化铁、2,4—二硝基苯肼,蒽酮,Molisch和坂口反应均为阴性。分子量是285,实验式：C₁₀H₁₃,N_4O4．H_2O。比旋光度[a]20D=-35.5(C=1%,0.1 NHCI);[a]24D=-72．11(C一1％,甲醇)。熔点141—142℃。紫外吸收光谱：234毫 微米(E1%厘米=280)和295毫微米(E11%厘米=340)(0.1NHCl);295毫微米(E11%厘米=380)(蒸馏水);235毫微米(E11%厘米=500)和305毫微米(E11%厘米=260)(0.1NNaOH)。高教地抑制稻白叶枯病黄杆菌,对稻瘟病菌和分棱杆菌607,也有较强的抑制作用。     

猪心细胞色素C的反胶团萃取研究

本文研究了AOT/异辛烷对猪心CytC的萃取,分析了不同AOT浓度、pH值条件、体积比、阳离子种类以及离子浓度对反胶团萃取猪心CytC的影响,结果表明;AOT浓度增加,对CytC的萃取率提高;在pH6～9之间对CytC有较好的萃取效果;Mg~(2 )、Na~ 、K~ 、Ca~(2 )”、Mn~(2 )、Li~ 离子中以Li~ 和Mg~(2 )的效果最好,其顺序为:Li~ >Mg~(2 )>Na~ >Ca~(2 )>K~ ,而 Mg~(2 )在0.025mol/L时萃取率最好,可达96.5％;当油:水体积比增大时,萃取率也增大。     

玉米根质膜ABA结合蛋白的增溶及特性研究

以玉米(Zea mays L.)根为材料,采用分级离心和两相分配法制备高纯度的质膜。实验比较了Tri-ton X-100和丙酮两种增溶剂对膜上ABA结合蛋白(ABA-BPm)的增溶效果。结果表明0.2％(W/V) TritonX-100的增溶效率超过85％,而丙酮法增溶效率仅达65％。放射配基(~3H-ABA)结合分析表明,增溶的膜蛋白与ABA的结合反应具有竞争性、饱和性、专一性和高亲和性等特点,而相同反应条件下的BSA则没有这些特征,证明了质膜上存在着ABA结合蛋白。实验还比较了ABA-BPm与增溶的ABA结合蛋白(ABA-BPs)与ABA的特异结合活性,结果显示ABA-BPs对反应温度和介质pH更为敏感,保持最大结合活性的时间也较短(<30min),暗示着增溶膜蛋白离开膜脂环境后更不稳定、易失活。     

Mg~(2 )离子对紫膜表面电位效应的自旋探针—ESR研究

本文根据带正电荷自旋探针CAT_(12)在紫膜结合相和水相的分布,利用自旋探针顺磁共振(ESR)技术测定了Mg~(2 )对紫膜表面电位的影响,我们的结果表明紫膜具有σ为3.02×10~(-4)Ch-arges/(?)~2的表面电荷密度.据此σ用Gouy-Chapman理论计算得到Mg~(2 )离子浓度与表面电位((?)_i)的关系与实验结果极为一致,这表明离子通过表面电位的变化引起紫膜的表面pH值的改变从而影响紫膜的结构与功能,Mg~(2 )对紫膜表面电位的影响明显地比K~ 要大,说明镁离子可能在紫膜的结构与功能中有更为重要的作用.     

Mg~(2+)离子对紫膜表面电位效应的自旋探针—ESR研究

本文根据带正电荷自旋探针CAT_(12)在紫膜结合相和水相的分布,利用自旋探针顺磁共振(ESR)技术测定了Mg~(2+)对紫膜表面电位的影响,我们的结果表明紫膜具有σ为3.02×10~(-4)Ch-arges/(?)~2的表面电荷密度.据此σ用Gouy-Chapman理论计算得到Mg~(2+)离子浓度与表面电位((?)_i)的关系与实验结果极为一致,这表明离子通过表面电位的变化引起紫膜的表面pH值的改变从而影响紫膜的结构与功能,Mg~(2+)对紫膜表面电位的影响明显地比K~+要大,说明镁离子可能在紫膜的结构与功能中有更为重要的作用.     

不同实验方法检测常用有机溶剂对细菌活性的影响及其安全使用限量

【目的】采用不同实验方法测定常用有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)、丙酮和乙醇对细菌活性的影响,以指导抗菌类药物体外抑菌实验所用溶剂的选择和添加限量。【方法】采用常规体外抑菌实验方法(纸片扩散法、肉汤稀释法),并参照生长曲线法检测有机溶剂DMSO、丙酮和乙醇对大肠杆菌(Escherichia coli)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌作用,采用扫描电子显微镜(SEM)观察溶剂作用后的细菌形态变化。【结果】3种溶剂对E.coli和S.aureus抑菌率达到20%时,在肉汤稀释法下,DMSO、丙酮、乙醇的浓度(体积比)分别为1.00%、0.25%、2.00%和1.00%、1.00%、0.50%;在生长曲线法下,溶剂浓度(体积比)分别为0.50%、1.00%、0.50%和1.00%、0.50%、0.50%;而在纸片扩散法下,32%(体积比)DMSO和32%(体积比)乙醇对E.coli产生明显抑菌圈,但3种溶剂对S.aureus均无抑菌圈出现。3种方法比较后得出:当3种溶剂的抑菌率达到20%时,溶剂浓度(体积比)均低于0.5%,对细菌整体生长活性影响较小。SEM结果表明控制溶剂使用限量可有效减少其对E.coli生长过程的影响。【结论】相对于DMSO和丙酮,乙醇对微生物生长繁殖能力的影响更加明显;采用相同浓度有机溶剂时,液态条件下(肉汤稀释法和生长曲线法)微生物受到有机溶剂的影响较大。     

反胶束萃取技术分离胰激肽原酶

研究了用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）/正己醇/正辛烷反胶束溶液萃取和反萃取商业用胰激肽原酶时,水相pH值、离子强度和种类、CTAB浓度和助表面活性剂浓度等因素对分离效率的影响,并从反胶束微观结构给予解释。结果表明：［CTAB］＝0.02 mol•L-1,正己醇／正辛烷(V/V)＝1：5,萃取pH＝9.0,反萃pH＝7.0,萃取［KBr］＝0.1 mol•L-1,反萃［KBr］＝1.5 mol•L-1,反萃取加15％乙醇(V/V)时,萃取率接近100%,反萃取活性回收得率在80%以上。商业用酶的纯化倍数最高为1.97倍,粗酶为7.15倍,且粗酶纯化后比活在200U／mg以上,电泳分析证实了纯化效果,显示了很好的工业前景。     

用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶拆分DL-苯丙氨酸

为了将手性化合物D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸进行分离,利用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶催化的方法对其拆分．试验结果表明,用DL-苯丙氨酸合成N-乙酰-DL-苯丙氨酸,得率为88.7％．木瓜蛋白酶、海藻酸钠 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(IPSAC)、尼龙布固定化木瓜蛋白酶(IPN)催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺时,对催化合成过程影响最大的因素分别是溶液中的离子强度、溶液中的离子强度、反应温度;溶液中的离子强度与pH对合成的影响较大．本试验得出分别用木瓜蛋白酶、IPSAC、IPN催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺的3个最佳方案;用此3个方案合成时,产率分别为61.2%、54.7%、36.3%．N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺水解生成L-苯丙氨酸,产率59.2%,光学纯度为96.6％．N-乙酰-D-苯丙氨酸水解生成D-苯丙氨酸,产率61.7%,光学纯度为95.7％．     

人C-反应蛋白的等电点的测定

人C-反应蛋白(CRP)等电点的最早报道为1954年Wood等用自由电泳法测定为今4.82。我们在1983年用等电聚焦法测定为5.2,但在PH4.7及6.6处亦有两条区带。后来看到Laurent等用滴定曲线法测CRP的pI为6.3±0.2,但在pH7.2-8.5间;4.0-5.0间亦有其等电点区,后者可能为酸变性CRP的等电点。我们也用此法测定自制的并纯化了的CRP等电点,所得曲线与报道相似,但由于滴定曲线与样品槽在比较宽的pH范围内均非常接近,交点(即等电点)不易读出,因而我们改用了聚焦-免疫双向电泳法,得到比较满意的结果。测得人CRP的等电点为5.7-6.0,在pH7.2-8.5或4.0-5.0间,均无区带出现。     

青霉吸附水体重金属铬条件与特性研究

目的:研究青霉(Penicillium lh-1)作为吸附剂去除水体中六价铬的吸附条件与吸附特性.方法:菌种摇瓶培养收获茵体,干燥粉碎分选,添加吸附剂到体积100ml浓度50mg/L六价铬溶液中,对最优吸附温度、pH、共存离子以及铬被吸附形式进行研究.结果:①温度28℃以及酸性环境(pH 3)为最优吸附条件,10 h内,Cr(Ⅵ)的生物吸附去除效率达99%.②铬的生物吸附主要以六价形式,约占80%,部分Cr(Ⅵ)被还原成Cr(Ⅲ),约占20%.③溶液中共存离子对六价铬吸附的影响不同,一价阴离子与Cu2+对Cr(Ⅵ)的吸附几乎没有影响,二价阴离子和Ni2+的存在却明显地影响了生物吸附剂对Cr(Ⅵ)的吸附.结论环境温度、溶液pH以及溶液中共存离子对铬的生物吸附有显著的影响.     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅳ.溶液中的缔合性质、酪氨酸微区及主链构象

研究去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的空间结构对了解胰岛素分子的结合部位是重要的,本文研究了它的部分空间结构性质。1.用凝胶过滤法研究了DPI的性质,说明接近生理环境的条件下(pH7.0,离子强度0.3),DPI没有自缔合性质,而是以单体存在。因此推论胰岛素的作用单位是单体,它以单体与受体结合并传递信息。2.用紫外差吸收法测定了DPI的pH差光谱,变性差光谱与热变性曲线。这些结果说明DPI的三个酪氨酸侧链暴露在分子表面。3.测定了DPI的圆二色性(CD)曲线。pH7.0时,远紫外CD曲线与胰岛素相似,但[θ]220毫微米负值变小。这可能说明DPI的主链与胰岛素基本相同而略有松散。近紫外CD曲线与胰岛素很不相同,谷顶在266毫微米,[θ]负值变小。讨论了Phe与-S-S-提供贡献的可能。结合本系列工作的Ⅲ、Ⅳ两文,可以认为,DPI的空间结构研究的结果支持胰岛素分子二体内单体间的疏水面是结合部位的一部分这一假设。     

几种二价阳离子及表面活性剂对元麦叶原生质体电泳率的影响(简报)

原生质体电泳率的研究已应用于了解质膜表面的电荷特性。Ca~( )能影响原生质体质膜表面的电荷状况,在诱导融合时起重要作用。关于二价阳离子对质膜功能的影响,Caldwell报道了Ca~( )、Mg~( )、Mn~( )等多种二价阳离子对质膜ATP酶不同的激活效应。此外,Helenius等指出表面活性剂能改变膜的结构,并与膜脂作用而引起溶胞。为进一步了解不同的二价阳离子对质膜电荷特性的影响,及表面活性剂在改变膜结构这一复杂过程中对质膜电性影响的状况,我们报道Ca~( )、Mg~( )、Mn~( )等二价阳离子及几种表面活性剂对原生质体电泳率影响的结果。     

叶绿体膜的结构与功能 Ⅷ.镁离子对叶绿体类囊体膜的叶绿素-蛋白复合体聚合的影响

小麦叶绿体类囊体膜用SDS短时间增溶后,在不连续的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离出七条含叶绿素的带,我们依其迁移率的增加及参考文献上的定名,称为CPI_a、CPI(P700-叶绿素α-蛋白质)、LHCP~1、LHCP~2、CP_a(含光系统Ⅱ反应中心的复合体)、LHCP~3(捕光叶绿素α/b-蛋白质)和FC(游离色素-SDS复合物)。在叶绿体类囊体膜的SDS提取物中加入Mg~( )后,则只能分离出四条含叶绿素的带,依其迁移率,并经室温吸收光谱和萤光光谱鉴定为CPI、CP_a、LHCP~3和FC。Mg~( )强烈地引起CPI_a和CPI相聚合,LHCP~1、LHCP~2和LHCP~3相聚合。聚合后的蛋白复合体的吸收光谱表明:CPI在红区的吸收峰为675nm,蓝区的吸收峰为436nm;CP_a在红区的吸收峰为669nm,蓝区的吸收峰为434nm;LHCP~3在红区的吸收峰为652和671nm,蓝区的吸收峰为436和470nm。分别与对照的CPI、CP_a和LHCP~3的吸收光谱相类似。而室温下二者的LHCP的萤光激发光谱和发射光谱也彼此相似。Mg~( )引起LHCP的聚合对叶绿体类囊体膜的结构具有重要意义。值得注意的是在叶绿体类囊体膜的SDS提取物中加入Mg~( )后,引起CPI_a与CPI的聚合,这种聚合对膜的结构与功能的影响目前仍不清楚,还有待进一步探索。     

叶绿体膜的结构与功能——Ⅷ.镁离子对叶绿体类囊体膜的叶绿素-蛋白复合体聚合的影响

小麦叶绿体类囊体膜用SDS 短时间增溶后,在不连续的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离出七条含叶绿素的带,我们依其迁移率的增加及参考文献上的定名,称为CPI_(?)、CPI(P700-叶绿素a-蛋白质)、LHCP~1、LHCP~2、CP_(?)(含光系统Ⅱ反应中心的复合体)、LHCP~3(捕光叶绿素a/b-蛋白质)和FC (游离色素-SDS 复合物)。在叶绿体类囊体膜的SDS 提取物中加入Mg~( )后,则只能分离出四条含叶绿素的带,依其迁移率,并经室温吸收光谱和萤光光谱鉴定为CPI、CP_a、LHCP~3和FC。Mg~( )强烈地引起CPI_(?)和CPI 相聚合,LHCP~1、LHCP~2和LHCP~3相聚合。聚合后的蛋白复合体的吸收光谱表明:CPI 在红区的吸收峰为675nm,蓝区的吸收峰为436nm;CP_(?)在红区的吸收峰为669nm,蓝区的吸收峰为434nm;LHCP~3在红区的吸收峰为652和671nm,蓝区的吸收峰为436和470nm。分别与对照的CPI、CP_(?)和LHCP~(?)的吸收光谱相类似。而室温下二者的LHCP 的萤光激发光谱和发射光谱也彼此相似。Mg~( )引起LHCP 的聚合对叶绿体类囊体膜的结构具有重要意义。值得注意的是在叶绿体类囊体膜的SDS 提取物中加入Mg~( )后,引起CPI_(?)与CPI 的聚合,这种聚合对膜的结构与功能的影响目前仍不清楚,还有待进一步探索。     

植物细胞表面蛋白的分离和鉴定

我们发现用十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤植物细胞,可以分离到两种蛋白。不同植物细胞的这两种蛋白,除了电泳淌度稍有不同以外,最主要的差异是量的不同。由于烟草细胞取材方便,我们对其进行了初步的分离和鉴定。SDS浸提液的紫外吸收光谱在230～240nm之间有一个肩,在260～280nm之间有一个吸收峰。Sephadex G-200凝胶过滤层析显示出两个既有茚三酮阳性反应,又含有中性糖的峰。汇集这两个峰的冼脱液进行超离心分析,结果证明是两个大分子。洗脱液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,用考马斯亮蓝R-250和过碘酸-Schiff试剂染色,结果表明是两种糖蛋白。这两种糖蛋白用沉淀剂三氯乙酸和磷钨酸可以分开:其一是含糖量超过30％的粘蛋白,另一是含糖量不到10％的糖蛋白。氨基酸组成分析结果表明:SDS浸提的蛋白象细胞壁蛋白一样,都是富羟脯氨酸蛋白。不同的是,SDS浸提的蛋白羟脯氨酸含量超过胞壁蛋白一半以上。SDS浸提蛋白的冻干样品处观是一种有网眼结构的膜状物,磷钨酸变性后在电镜下可以观察到丝状结构。烟草细胞的SDS可浸提的蛋白含量,在细胞生长最快时显著降低。