基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展

数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术．该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数．DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量DNA拷贝数的关键因素．本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量PCR的区别,以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展,并展望了该技术的应用前景．     

凝胶成像系统对核酸扩增产物的定量检测

目的 建立一种PCR-凝胶成像系统定量分析核酸扩增产物的方法．方法：1．用PCR荧光定量分析仪实时监测PCR扩增曲线,并选择合适的扩增循环次数,2．将梯度标准血清(10^1～10^6拷贝／u1)分别进行40,35及32次循环次数的扩增,在琼脂糖电泳,EB染色后,进行凝胶分析;3．选择凝胶分析软件中能客观反映核酸实际含量的最适参数,制定标准曲线。结果:40及35次循环时,在10^1～10^4拷贝／ul,线性良好,而在10^4,10^5及10^6拷贝／ul三个梯度时直线上升缓慢,趋于平坦;32次循环时,10拷贝／ul未能检出,10^2～10^6拷贝／ul的5个梯度的模板(对数值)与产物(体积)有良好的线性关系(r=0．97)。结论：32次循环线性范围较广,为最适循环次数;在UVIband的光密度定量分析指标中,以体积或体积百分比作为定量指标较好;本法除可用于常规PCR产物定量(HBV-DNA,TB—DNA),也适用于RT-PCR(HCV-RNA)。     

快速PCR方法在法医DNA检验中的研究进展

目前法医DNA检验应用的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)复合扩增系统均依赖于荧光标记的多重PCR方法。常规DNA检验流程包括提取、定量、扩增、分离和检测,而多重PCR扩增常常是整个过程中的限速步骤,完成28~30个循环大约需要3 h。以往常利用商业化的热循环仪和热稳定DNA聚合酶,但需要很长的PCR循环时间才能够确保100~400 bp的目标片段得到有效且均衡的复合扩增。随着各种缩短扩增时间方法的出现,STR复合扩增不再需要3 h,而是可以减少到几十分钟甚至十几分钟。现主要总结了快速PCR、直接PCR、芯片PCR以及其他快速扩增等方法的研究现状与进展,尤其是在法医DNA检验领域,同时对比了几种常见快速PCR扩增方法,可见缩短扩增时间对DNA检验的意义重大。未来,以芯片为主导、快速检验为目的的全自动、便携式、集成化的DNA分析系统,将使得法医DNA检验从实验室走进案件现场,甚至日常生活,实现真正的快速即时检验。     

套式PCR检测体系扩增效率的分析及对假阳性的控制

用扩增效率等量化的指标来控制PCR检测过程中出现的假阳性,调查了受假阳性污染的试剂在特定的PCR检测系统和环境中产生假阳性的PCR循环数界限,采用模板量与扩增倍数的线性回归关系分析系统的扩增效率并以此测定计算了两个不同循环数系统（C27＋15）和C27＋20）的检测界限分别为0．78kg和0．065fg,提出以此检测界限的1／2量作为假阳性耐受量,两个不同循环数系统的假阳性耐受量分别为580个和48个拷贝。     

基于不同PCR方法的Ⅱ型鲤疱疹病毒检测技术研究

异育银鲫"鳃出血病"是一种因感染了鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)而引起的疾病,近年来给江苏异育银鲫养殖业造成了巨大的经济损失。为了能够建立及时、有效检出Ⅱ型鲤疱疹病毒的技术,本研究在克隆了Cy HV-2解旋酶基因和三联体蛋白基因的基础上,建立了检测CyHV-2的普通PCR、双重PCR、巢式PCR、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR等方法,并对这5种PCR技术检测Cy HV-2的灵敏性进行了系统研究。结果表明,针对CyHV-2病毒的解旋酶基因和三联体蛋白基因,普通PCR能够检测出的极限值是2.4×10~4 copies/μL,双重PCR是1.4×10~4 copies/μL,巢式PCR是2.4×10~(-2)copies/μL,荧光定量PCR是2.4×10~(-2)copies/μL,环介导等温扩增是3.5×10~2 copies/μL。通过采用以上方法对从不同地区采集的54尾异育银鲫提取的DNA为模板进行临床检验,测定不同检测方法的阳性检出率。结果表明,实时荧光定量PCR和巢式PCR的检出率很高,分别为89%和90.7%;普通PCR的检出率最低,为68.5%。综合检测灵敏度和阳性检出率,环介导等温扩增(LAMP)是一种适用于生产实践的能有效检测CyHV-2的良好技术。     

植物转基因成分PCR检测内对照系统的建立

为了建立适用于多种植物的转基因成分PCR检测的内对照系统,本文针对植物叶绿体DNArbcL基因的保守区域,设计了一对扩增片段为433bp的PCR引物。通过对23种植物的PCR扩增表明,该引物不但在4种单子叶植物（大米,玉米,小麦,洋葱）,10种原始花被亚纲的双子叶植物（甘蓝,白菜,大豆,豇豆,花生,胡萝卜,芹菜,菠菜,大麻,棉花）及7种合瓣花亚纲的双子叶植物（圣女果,番茄,辣椒,马铃薯,南瓜,黄瓜,菊苣）中得到了稳定一致的扩增结果,而且在低等的藻类植物（海,经须菜）中也得到了特异性的扩增结果。进一步对扩增片段进行的DNA序列测定与分析表明,扩增片段的变异水平较低,具有较高的保守性。本系统的建立有助于排除PCR检测时的假阴性结果,从而提高检测的准确性,而且能克服现行的“一种植物一种检测内对照”的弊端,有利于提高检测效率,缩短检测周期。     

古DNA实时荧光定量PCR实验中标准品的制备

实时荧光定量PCR技术通过对PCR每一循环扩增产物的实时检测,可对模板的精确拷贝数进行绝对定量,从而用于古DNA实验中提取和扩增条件的比较和优化.本研究采用异硫氰酸胍碱裂解-SiO2吸附的方法,从采自黑龙江省的晚更新世斑鬣狗化石材料中提取得到了斑鬣狗线粒体基因组古DNA.经常规PCR扩增后,将纯化的扩增产物克隆到微生物体内使其大量复制,再用M13通用引物扩增出含少量外源DNA的古DNA目标片段,从而建立了适用于古DNA荧光定量PCR扩增的标准品的制备方法.经检测分析,运用该方法制备的标准品性质稳定,能够准确地指示反应体系中较为精确的古DNA模板拷贝数,从而反映古DNA的提取和扩增效率,用于比较并优化古DNA提取和扩增条件.     

实时定量PCR及其在轮状病毒检测中的应用

实时定量PCR(Real-time polymerase chain reaction/quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR/qPCR)就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号对PCR进程进行实时监测。它具有特异性强、灵敏度高、定量准确和快速等优点,在生物医学领域中得到广泛的应用。对实时定量PCR技术的原理和类型,实时定量PCR技术在生物医学领域的应用,尤其在轮状病毒诊断、检测及疫苗研究中的应用及其未来前景进行了综述。     

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估. 结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%~101.479%正常范围内（R2≥0.995）,定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.     

硅-玻璃聚合酶链式反应微芯片对β-葡糖苷酸酶基因的扩增

聚合酶链式反应（PCR）微芯片是基于微机电系统（MEMS）制作,在微芯片上进行PCR反应,实现生物样品扩增的一项新技术.介绍了硅-玻璃PCR微芯片的设计和制作、微反应腔的清洗和表面处理、借助外置温度控制系统进行PCR扩增反应以及扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下的检测分析,实现了对β-葡糖苷酸酶（GUS）基因的有效扩增,扩增时间由原来的90 min缩短到现在的37 min.     

小麦内源特异参照基因的查找与定性PCR和实时荧光PCR验证

目的:先从理论上查找和比对了小麦属(Triticum)γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法从实验特异性上进行了验证。方法:选择小麦基因组中部分基因序列在NCBI中进行同源性分析,查找在小麦中存在的内源特异参照基因,找到小麦属(Triticum)特异的γ-醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成该基因的引物和探针序列,同时用定性PCR和实时荧光PCR方法进行检测,并优化了实验条件。结果:不仅在理论上查找和比对了γ-醇溶蛋白基因为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法进行了实验特异性的验证。定性PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,只在小麦属中可以检测到328bp的目的片段,而在其它作物中未扩增出目的片断。同样实时荧光PCR验证的结果小麦属内各个种均有扩增曲线出现,而在其它作物没有扩增曲线出现中。结论:该基因与方法可用作检测小麦属(唯一小麦种是栽培作物)内源特异参照基因。     

疾病分析的尖端利器——LightCycler 480Ⅱ实时定量PCR系统介绍

罗氏应用科学部积十年实时定量PCR系统与试剂研发之丰富经验,结合德国顶尖工业设计与制造体系,于2006年推出全球首台可灵活转变通量的实时定量PCR系统LightCycler 480。     

基于16S rDNA基因的谷斑皮蠹PCR检测技术

【目的】谷斑皮蠹是一种重要的检疫性害虫,在新疆周边多个国家分布,口岸检疫人员多次从进境货物中截获谷斑皮蠹,该虫对新疆的农业生产极具威胁。【方法】以谷斑皮蠹的16S rDNA基因为靶序列,用昆虫通用引物对4种供试皮蠹进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆和测序,用生物软件设计检测谷斑皮蠹的特异性引物与探针。【结果】设计的特异性引物(TG-SNP-F/TG-SNP-R)及所建立的常规PCR方法能有效检测出谷斑皮蠹,其扩增产物的片段大小为250 bp,灵敏度为3 ng·μL~(-1)。设计的特异性引物(TG-F/TG-R)和探针(TG-probe),以及所建立的实时荧光PCR方法,对谷斑皮蠹的检测特异性强,灵敏度达0.8 fg·μL~(-1)。【结论】建立的常规PCR方法和实时荧光PCR检测方法能够对谷斑皮蠹进行准确鉴定,为口岸检疫人员检测进境货物中携带的谷斑皮蠹提供技术支持。     

荧光定量PCR 方法及分子标志物在海洋污染监测中的应用进展

荧光定量PCR 作为一种核酸定量技术, 可在PCR 扩增时在体系中加入荧光染料或荧光基团, 实时监测荧光信号从而对PCR 扩增产物进行实时准确定量, 技术灵敏度高, 特异性强。通过对荧光定量PCR 的原理、分类、优缺点及几种定量分析方法对比进行简述, 并对其在国内外海洋环境污染监测中的广泛应用和研究进行了全面综述, 从而对荧光定量PCR 和分子标志物在海洋监测中的应用前景做进一步的展望。     

博尔纳病病毒持续感染细胞系中病毒RNA的原位PCR检测

目的建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的原位PCR方法。方法首先设计BDV特异性引物以及检测BDV-RNA的原位PCR扩增系统．然后对BDV持续感染细胞(BDV／OL)和正常细胞(OL细胞)爬片进行原位PCR扩增,进而分别用DNA酶或RNA酶消化处理BDV／OL细胞爬片后,再进行原位PCR扩增。结果经原位PCR扩增后．约60％～70％的BDV持续感染细胞核中出现了阳性反应信号,但正常细胞无信号出现,并且病毒感染细胞中的阳性信号在RNA酶消化作用下消失,但不受DNA酶作用的影响。结论该研究建立的PCR检测方法具有BDV和RNA特异性,可以应用于检测相关动物或神经精神疾病患者的脑组织中BDV-RNA,为进一步证明BDV的致病性奠定基础。     

数字PCR技术及其应用进展

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数。相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广。本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述。     

实时PCR技术在植物研究上的应用

实时PCR是在常规PCR基础上运用荧光共振能量转移现象,加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起的一项新技术,具有快速、灵敏、特异性强、定量准确等特点,广泛应用于医学、检验检疫、军事、农业、基础研究等领域。着重就实时PCR技术的特性及在植物上的应用进行了讨论,并与目前常用的相关技术进行了比较。     

数字PCR技术及其应用进展北大核心CSCD

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数。相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广。本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述。     

猪组织中miR-103实时定量PCR分析时合适内参的确定

定量实时PCR是miRNA表达检测的主要方法之一,而利用合适内参对定量实时PCR数据进行校正处理是确保该方法分析准确性的关键.为了确定猪正常组织中miR-103定量实时PCR检测分析的合适内参,首先采用geNorm算法和扩增效率试验对miR-196、U6 snRNA和总RNA 3个候选内参进行了评价;然后以miR-103的绝对定量结果为对照,比较分析了3个候选内参的校正准确性．结果表明,miR-196的表达稳定性和扩增效率均优于U6 snRNA和总RNA;以miR-196为内参的miR-103相对定量结果同绝对定量结果具有较高的一致性,两者均显示miR-103在猪大脑中高丰度表达,在胃、小脑、小肠、心脏、肝脏和胰脏中适度表达,在肺、脾脏和腿肌中轻度表达.这些结果说明,miR-196可作为猪正常组织中miR-103定量实时PCR相对定量分析的一个合适内参.     

PCR技术的新进展

PCR是用于在体外快速酶促扩增特定DNA片段的技术,本文对PCR技术的一些新方法进行了简要综述,包括易错PCR,DNA shuffilng,原位PCR,电子PCR,固相PCR和PCR芯片。