毕赤酵母Kex2蛋白酶的同源表达及酶学性质 *

Kex2蛋白酶是一种来源于酵母的前体加工蛋白酶。利用毕赤酵母(Pichia pastoris)同源表达来源于毕赤酵母的Kex2蛋白酶(PPKex2),研究其表达特性和酶学性质,同时与毕赤酵母表达的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Kex2蛋白酶(SCKex2)进行比较。首先,分别从毕赤酵母和酿酒酵母基因组中获得Kex2基因,将其插入到表达载体pPIC9K中,并转化毕赤酵母菌株GS115。重组菌株经甲醇诱导表达后,结果表明PPKex2的发酵上清液比活是SCKex2的7倍。Kex2蛋白酶经Q-FF强阴离子交换柱纯化后进行酶学性质研究。酶学性质研究结果表明,PPKex2的最适反应pH是8.0~9.0,最适反应温度是37℃,与SCKex2性质相近。在稳定性方面,PPKex2在pH 7.0时最稳定,在碱性条件下的稳定性高于SCKex2,在酸性条件下的稳定性低于SCKex2,另外PPKex2的温度稳定性略低于SCKex2。酶促反应动力学研究表明,PPKex2的k_cat和k_cat/K_m值分别为SCKex2的4.8倍和3.3倍。首次报道了同源表达毕赤酵母Kex2蛋白酶的表达特性及酶学性质,为其今后的研究及应用奠定了基础。     

马铃薯α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其酶学性质的研究

采用RT-PCR法扩增马铃薯夏波蒂的α-淀粉酶成熟肽基因,将其亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9k上,SacII线性化重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,构建重组酵母GS115/pPIC9k-amy,利用锥虫蓝法筛选获得高活性转化子(GSamyA5),以终浓度为0.5%甲醇诱导该重组菌表达α-淀粉酶,通过Ni~(2+)-NTA agarose亲和层析纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:该酶的最适反应温度为45℃,40~50℃酶活较稳定,保温50 min,残留相对活力达92.6%;最适反应pH值为6.0,并在pH 6.0~7.0范围内酶活保持稳定。Ca~(2+)、K~+可促进酶反应,以Ca~(2+)影响为最,相对酶活力提高到125%;Cu~(2+),Fe~(2+),Fe~(2+),Zn~(2+)对该酶有显著抑制作用;Mn~(2+),Mg~(2+)对酶有微弱抑制作用,Li~+、Na~+对酶活影响不大。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

超嗜热酯酶EST2在不同宿主中的异源高效表达研究

来源于超嗜热古菌Alicyclobacillus acidocaldarius的酯酶EST2是目前报道的活性最高的超嗜热酯酶,具有极大的工业应用价值。为促进EST2的生产应用,将其分别在大肠杆菌及毕赤酵母中进行异源表达,并就不同宿主对表达情况和重组酶酶学性质的影响进行了分析。在大肠杆菌和毕赤酵母中重组表达的EST2酶学性质基本一致:最适温度分别为75℃和77.5℃,最适pH均为8.0,比活力分别为4656.6 U/mg和4078.3 U/mg,70℃水浴保温4.5 h,残余活力均在70%以上。在摇瓶发酵的基础上,于5 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌及毕赤酵母的高密度发酵。毕赤酵母高密度发酵120 h菌体干重达68 g/L,最大表达酶活力为959.6 U/ml。大肠杆菌高密度发酵25 h菌体干重达60.8 g/L,最大酶活力14825.6 U/ml,表达量是毕赤酵母的15.4倍,单位时间产量是酵母的74.2倍。结果表明大肠杆菌发酵周期短、表达量高,更适合进行嗜热酯酶EST2的高效生产,这为促进嗜热酯酶在工业生物技术产业的应用奠定了基础。     

新型海洋源β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的表达与酶学性质

从海洋环境β-半乳糖苷酶基因出发,采用毕赤酵母表达体系,构建产β-半乳糖苷酶的基因工程菌,并对重组酶酶学性质进行表征。结果发现:海洋源β-半乳糖苷酶具有优良的乳制品用酶特性,该重组酶的最适pH为7.0~8.0,最适温度为45℃,在50℃以下孵育1 h可保持55%以上的活力,能耐受Fe~(2+)、Na~(2+)、K~(2+)、Ca~(2+)等多种金属离子。宽广的pH、温度、金属离子稳定性,以及低温活性赋予该酶良好的乳制品用酶特性。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。     

反刍兽月形单胞菌β-木糖苷酶基因在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

β-木糖苷酶(β-xylosidase,酶编号EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系中的重要组成部分。本研究以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主菌尝试表达反刍兽月形单胞菌Selenomonas ruminantium中的β-木糖苷酶基因Sxa。根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、mRNA二级结构、GC含量和稀有密码子,对Sxa基因进行优化;通过基因合成技术获得了全长基因mSxa并构建重组酵母表达载体pPIC9K-mSxa;以BglⅡ酶切重组载体pPIC9K-mSxa,电击转化将m Sxa基因导入毕赤酵母GS115中,获得的转化子经过表型和遗传霉素G418抗性筛选、PCR鉴定,得到表达β-木糖苷酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-mSxa;通过活性测定获得高效表达β-木糖苷酶的重组酵母,并对重组β-木糖苷酶的酶学性质进行了初步研究。结果表明,重组β-木糖苷酶的分子量约为66 kDa。在发酵罐水平表达的酶活性达到了287.61 IU/mL。对酶学性质研究显示,该酶在温度为40-60℃,pH为5.0-7.0时较稳定,其最适反应温度和pH分别为55℃和6.0,专一性地作用于β-木糖苷键。Mn~(2+)和Ca~(2+)对该酶具有激活作用,而Fe~(3+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)、EDTA及SDS抑制其酶活性。本研究首次将反刍兽月形单胞菌的β-木糖苷酶基因转化到毕赤酵母中获得表达,并具有较高活性,为进一步工业化应用奠定了基础。     

构巢曲霉内切甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达及重组蛋白质的表征

【目的】内切甘露聚糖酶是一类重要的半纤维素酶,能够有效水解半纤维素的第二大组分甘露聚糖,已广泛应用于工业生物技术领域。【方法】本文对来源于腐生真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的一个内切甘露聚糖酶在毕赤酵母中进行过表达及详细的酶学性质研究。【结果】该甘露聚糖酶在摇瓶和发酵罐条件下都成功获得表达,发酵罐条件下的蛋白质表达量高达3.9 mg/mL;该酶的最适pH和温度分别为4.0和60°C,在pH 5.0–9.0之间表现出了很好的稳定性;在温度≤40°C时,该酶非常稳定,当温度≥60°C,该酶的稳定性大大降低;Co~(2+)和Zn~(2+)促进了该酶的活性,而Pb~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)等金属离子表现出了一定的抑制作用。【结论】该构巢曲霉来源的内切甘露聚糖酶能在毕赤酵母中高效表达,表现出了一定的耐酸、耐碱及耐热等性能,具有开发为商品酶的潜力,为深入开发构巢曲霉来源的其他糖苷酶奠定了基础。     

一种来自乳酸乳球菌的新型氨肽酶A的制备及特性分析

氨肽酶A(aminopeptidase A,Pep A)能特异性地水解N末端为谷氨酸(glutamic acid,Glu)或天冬氨酸(asparticacid,Asp)的肽链,提高蛋白质的水溶性和食物的风味,在食品工业和肉类加工中具有一定的应用前景。本研究采用全基因合成的方式获得了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis)IL1403氨肽酶A(Lactococcus lactis-Pep A,Lc-Pep A)的编码基因,将该基因克隆并导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(His4),在毕赤酵母中实现了Lc-Pep A的高效分泌表达,表达产物经鉴定和纯化制备后,进行了生物学特性的分析。结果表明,Lc-Pep A具有较强的底物特异性,对2种底物谷氨酸对硝基苯胺(glutamicacid-p-nitroaniline,Glu-pNA)和天冬氨酸对硝基苯胺(aspartic acid-p-nitroaniline,Asp-pNA)具有相似的催化活力和酶动力学参数。Lc-Pep A是一种金属蛋白酶,最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,具有较宽的热稳定性和酸碱稳定性。金属离子Co^(2+)、Mn^(2+)及Zn^(2+)等对酶活力具有不同程度的激活作用,而Ni^(2+)和Cu^(2+)对酶活力具有强烈的抑制作用。Lc-Pep A对常规蛋白酶抑制剂不敏感,但能被金属蛋白酶抑制剂、EDTA及二硫键还原剂抑制。这些研究为Lc-Pep A的生产和指导该酶的应用打下了坚实的基础。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.