甲羟戊酸途径限速步骤研究及其在产番茄红素重组大肠杆菌中的应用

甲羟戊酸途径(MVA途径)被引入重组大肠杆菌中,能够提高重组大肠杆菌中萜类化合物的合成能力。但因重组大肠杆菌中萜类化合物合成途径中间产物积累,导致细胞生长和萜类化合物合成受到限制。本研究在稳定表达MVA途径以及优化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC103中,用质粒高表达MVA途径和番茄红素合成途径关键基因,挖掘该途径的限速步骤。结果表明,ispA、crtE、mvaK1、idi和mvaD基因过表达后,细胞生长没有明显变化,番茄红素产量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%,说明这几个基因可能是合成番茄红素的限速步骤。mvaK1、mvaK2、mvaD三个基因在同一操纵子上,用mRNA稳定区(RNA stabilizing region)进行启动子文库(mRSL)调控mvaK1,相当于对3个基因同时调控。用高效基因组编辑技术(CAGO)对mvaK1基因的mRNA稳定区进行启动子文库的调控,得到菌株LYC104。番茄红素产量与对照菌株LYC103相比增加了2倍,细胞生长提高了32%。然后,利用CRISPR-Cas9技术在染色体lacZ位点整合idi基因,得到LYC105菌株。与出发菌株LYC103相比,细胞生长提高了147%,番茄红素产量增加了2.28倍。本研究在染色体上具有完整MVA途径的基础上,利用质粒高表达单个基因挖掘限速步骤,用同源重组方法整合限速基因、解除限速,为代谢工程构建高产菌株提供新策略。     

番茄红素基因工程菌多酶调控研究进展

作为类异戊二烯化合物中四萜的代表性产品番茄红素,在生物体中是典型的多酶参与催化的反应产物,在2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐(MEP)和甲羟戊酸(MVA)合成途径中起着至关重要的作用。从番茄红素在原核和真核中的多酶合成途径出发,针对番茄红素合成途径的各种优化策略,首先介绍了多酶合成中的常规调控方法,包括多基因共表达质粒构建、基因顺序调控、启动子与核糖体结合位点调控及基因敲除和替换等方法。之后介绍了一些新型的多酶调控方法,包括多片段组装技术、人工支架自组装方法等。最后重点介绍了这些多酶调控方法在番茄红素合成中的应用。这些多酶合成调控方法为构建高产番茄红素菌株提供了极大的启发和研究基础。     

基于2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4磷酸途径的产紫槐二烯大肠杆菌构建及其补糖策略优化

2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP) 途径是大肠杆菌Escherichiacoli 唯一的萜类前体合成途径,研究表明它比甲羟戊酸(Mevalonate, MVA)途径具有更高的理论产率。但目前有关MEP 途径的调控所知非常有限,故单独强化MEP 途径对萜类异源合成产量的提高效果并不理想。研究中通过引入外源MEP 途径基因强化E. coli 萜类合成的遗传改造策略和发酵过程补糖控制优化,尝试更有效地释放MEP 途径的潜力,建立青蒿素前体——紫槐二烯的高密度发酵过程。研究结果表明共表达阿维链霉菌Streptomyces avermitilis dxs2 基因和枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis idi 基因可使紫槐二烯的摇瓶发酵产量比野生菌株提高12.2 倍。随后针对该菌株建立了高密度发酵过程,发现稳定期的中前期(24?72 h) 是产物合成的关键期,通过稳定期补糖速率的调整,明显改善了产物合成速度,使紫槐二烯的产量从2.5 g/L 提高到了4.85 g/L,但不影响产物积累的周期。考虑到72 h 后菌体老化可能会影响产物合成,进一步采取了调整对数期的补糖速率控制菌体生长的策略,使紫槐二烯的产量达到6.1 g/L。研究结果为基于MEP 途径的萜类异源合成工程菌构建及其发酵工艺的建立奠定了基础。     

高效合成番茄红素酿酒酵母菌株的构建

番茄红素作为一种高附加价值的萜类化合物已受到国内外研究者的广泛关注。首先对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae模式菌株S288c和YPH499合成番茄红素的能力进行分析比较,结果表明YPH499更适合作为底盘细胞用于番茄红素的合成。随后比较组成型启动子GPDpr、TEF1pr和诱导型启动子GAL1pr、GAL10pr对番茄红素合成的影响,结果发现以GPDpr、TEF1pr作为番茄红素合成途径基因crtE、crt B和crtI的启动子,摇瓶发酵60 h后,番茄红素产量为15.31 mg/L;以GAL1pr和GAL10pr为启动子时,其产量为123.89 mg/L,提高8.09倍。继续改造甲羟戊酸(MVA)途径,过量表达N-末端截短的关键酶基因t HMG1(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶),番茄红素产量为265.68 mg/L,单位菌体产量72.79 mg/g。文中所设计构建的异源表达番茄红素合成途径的酿酒酵母菌株单位细胞产量高,可以进一步改造和优化后用于番茄红素的工业化生产。     

通过番茄红素环化酶的优化构建β-胡萝卜素高产菌株

目标产物的合成途径往往需要对关键酶的来源、表达水平等因素进行系统性优化才能实现代谢通量的最大化。β-胡萝卜素是一类具有重要应用价值的萜类化合物,其中番茄红素环化酶(Lycopene cyclase,CrtY)是β-胡萝卜素合成途径中的关键酶,能够催化FAD依赖的环化反应将番茄红素转化合成β-胡萝卜素。本研究通过对CrtY的系统优化提高β-胡萝卜素的合成水平,并确定CrtY的表达对代谢通路的影响。在大肠杆菌中以番茄红素合成模块为基础,通过引入番茄红素环化酶基因crt Y构建了β-胡萝卜素合成模块。并进一步利用寡聚接头介导的DNA组装方法 (Oligo-linker mediated assembly method,OLMA)引入一系列不同强度的人工设计的核糖体结合位点(Ribosome-binding site,RBS),对CrtY的表达强度、基因来源等因素进行高通量的优化。通过OLMA文库构建和平板筛选,获得了5株高产β-胡萝卜素的工程菌株。在摇瓶中,5株工程菌株的β-胡萝卜素产量可达15.79-18.90 mg/g DCW(Dry cell weight),比优化前提高了65%。进一步选取了其中的CP12菌株,在5 L发酵罐上,利用高密度培养技术验证工程菌株合成β-胡萝卜素的能力。最终β-胡萝卜素产量可达1.9 g/L。RBS强度分析及代谢中间体分析表明,适当地降低CrtY表达强度能够有利于β-胡萝卜素模块相关基因之间协同发挥作用。以上结果为β-胡萝卜素合成途径的优化规律提供了理论指导。     

大肠杆菌通过甲羟戊酸途径合成紫苏醇

紫苏醇,即[4-异丙烯基-1-环己烯]甲醇,是一种具有类似芳樟醇和松油醇特殊气味的单环单萜烯醇。在医药、食品和化妆品等行业具有广阔市场空间和研究价值。文中研究了以工程大肠杆菌通过甲羟戊酸途径合成紫苏醇的方法。首先在大肠杆菌中构建来源于粪肠球菌的MVA代谢途径合成柠檬烯,随后柠檬烯通过细胞色素P450烷烃羟化酶的羟基化转化为紫苏醇。然后将构建的紫苏醇合成菌株在摇瓶发酵条件下进行优化,研究发现工程大肠杆菌以葡萄糖为原料,通过MVA代谢途径可合成约50.12 mg/L的紫苏醇。本研究构建合成紫苏醇的MVA代谢途径也可用于其他萜类化合物的合成,为今后生物法合成萜类化合物提供了理论依据和技术支持。     

苏云金芽胞杆菌dxr1基因的转录受SigH控制

【目的】萜类化合物广泛分布在生物界,是重要的生命物质。目前发现有两条萜类化合物的生物合成途径,即甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。MEP代谢途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR,EC1.1.1.267)催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生成MEP。枯草芽胞杆菌中dxr基因编码DXR酶,而在苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)中有2个基因(dxr1和dxr2)编码DXR酶。通过分析BtHD73菌株的dxr1基因的转录活性和dxr1突变体表型,明确dxr1基因的转录调控机制和功能。【方法】通过5?RACE分析dxr1的转录起始位点;β-半乳糖苷酶活性测定分析dxr1基因启动子(Pdxr1)的转录活性;采用同源重组技术分别敲除BtHD73菌株的dxr1和dxr2基因;利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量;利用DXR检测试剂盒检测Bt菌株的DXR活性。【结果】dxr1基因的转录起始位点位于起始密码子上游39 bp处的G碱基;与出发菌株HD73相比,Pdxr1在sig H突变体中的转录活性明显降低;dxr1或dxr2基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使DXR活性下降。【结论】Bt中dxr1基因的转录受Sig H控制,dxr1基因的缺失影响DXR的活性。     

强化类球红细菌辅因子NADPH再生以提高法尼醇的产量

法尼醇(Farnesol,FOH)是由焦磷酸异戊烯基(IPP)和焦磷酸二甲基烯丙基(DMAPP)合成的法尼酰基焦磷酸盐(FPP)去焦磷酸化作用生成的。在类球红细菌中IPP和DMAPP是由MEP途径生成,而完整的MEP途径需要消耗大量的辅因子NADPH,增加胞内NADPH的量有可能强化FOH的合成。文中从增加NADPH的生成和降低NADPH的消耗这两个策略出发,分别干扰了编码6-磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的表达,同时强化了磷酸戊糖途径中6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因(zwf)和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因(gnd)的表达。实验结果表明,经改造的菌株NADPH含量显著增加,干扰菌株中菌株RSpgii的产量较高,为3.91 mg/g,在过表达的菌株中同时过表达zwf和gnd基因的重组菌株(RSzg)的FOH产量提高到了3.43 mg/g。为了获得FOH产量更高的菌株,以RSpgii为出发菌株,分别与zwf和gnd组合调控,获得的菌株RSzgpi的产量达到了最高量为4.48 mg/g,是出发菌株RS-GY2产率的2.24倍。     

1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)及其编码基因

萜类物质是广泛分布于生物界的一类天然产物,也是重要生命物质。萜类物质通过甲羟戊酸(MVA)途径和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成,古细菌、真菌和动物及人的萜类物质主要通过MVA途径合成,而多数真细菌(即通常而言的细菌)则利用MEP途径。植物同时拥有两种途径但分别定位于细胞质和质体。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是MEP途径的第一个酶,也是该途径的关键调控位点。现从DXS在MEP途径中的作用、DXS结构、亚细胞定位和酶活性、编码基因及突变体等方面对DXS进行全面阐述。拟南芥DXS基因插入突变体cla1-1发生白化,DXS基因表达与类胡萝卜素等萜类物质积累密切相关,在转基因生物体中过度表达DXS可促进萜类物质合成。植物DXS具有典型的质体转运肽序列,决定了DXS的质体定位。完备的DXS活性分析体系为DXS抑制剂开发筛选等研究奠定良好基础。DXS由一至多个基因编码,随生物种类而异,根据同源性,植物DXS基因可分成两类。DXS基因家族不同成员具有不同的表达模式,但通常有一个成员在多种组织中广泛表达。     

大肠杆菌异源合成甲羟戊酸的适配性优化

[目的]对甲羟戊酸在大肠杆菌中的生物合成进行适配性优化。[方法]将来源于粪肠球菌的甲羟戊酸合成途径基因mvaE和mvaS引入大肠杆菌中,构建大肠杆菌甲羟戊酸合成体系。继而通过比较不同的表达系统和不同的RBS序列探究甲羟戊酸合成的最佳条件。接下来,考虑到乙酰辅酶A是连接大肠杆菌细胞代谢途径和外源甲羟戊酸合成途径的桥梁,通过加强乙酰CoA的代谢通量来继续提高甲羟戊酸的产量。[结果]采用pTrc99A载体,8 000 au的RBS强度下,大肠杆菌甲羟戊酸合成体系的效率最高,产量达到20.5 mmol/L;通过加强乙酰CoA的代谢通量,甲羟戊酸的产量继续提高到26 mmol/L。[结论]获得一株高产甲羟戊酸的大肠杆菌菌株,该菌株可用于合成甲羟戊酸,也可作为一平台菌株用于其他萜类化合物的生物合成。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.