菌体表面表达与活菌疫苗

展示表达是将目的蛋白基因与细胞表面结构蛋白融合,使目的蛋白表达并锚定于细胞表面的一项技术,微生物特别是细菌常用作展示表达的宿主。在大肠杆菌中,多种外膜蛋白、鞭毛蛋白、菌毛蛋白、脂蛋白等均已被用于表达和锚定外源蛋白,革兰氏阴性菌中,较明确的是蛋白Ａ可用以细胞表面的整合,Ｍ６蛋白也被尝试用于乳酸菌的展示表达,酵母表达体系中,将目的蛋白与凝集素融合可表达细胞表面,菌体表面表达的蛋白容易被免疫系统识别,能引起强烈的免疫反应。其中沙门菌、大肠杆菌、链球菌等展示表达的致病细菌或病毒的抗原和毒素用于免疫动物均能产生高滴度的中和抗体,用作疫苗大有前途。本文对表达体系和在疫苗方面的应用进行了概述     

枯草芽孢杆菌表面展示技术用于黏膜疫苗的研究进展

枯草杆菌全名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),因其优秀的益生特性及芽孢良好的抗逆性而备受研究者青睐,由于芽孢的特殊结构及独特的生理特性,是酶和免疫原等外源蛋白的理想锚定点。采用枯草杆菌进行芽孢表面展示被认为是表达高活性和高稳定性的外源蛋白的方法之一。本文主要对枯草杆菌芽孢表面展示抗原蛋白以生产黏膜疫苗的策略和应用前景进行综述。     

鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统的构建

为了比较不同锚钩蛋白基序结合活性,构建新型的鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统。首先,用热酸处理法制备鼠李糖乳杆菌GEM(Gram-positive enhancer matrix,GEM)颗粒,并通过电镜观察、RT-PCR检测和SDS-PAGE检测鉴定其处理效果;同时,利用大肠杆菌表达了锚定蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP并将其与GEM颗粒共同孵育结合;最后,使用免疫印迹、电镜观察、荧光显微镜观察和荧光分光光度法评价鼠李糖乳杆菌GEM颗粒与锚定蛋白的结合效率。结果表明,使用10%的TCA处理鼠李糖乳杆菌得到了灭活的肽聚糖骨架(GEM颗粒),经鉴定其大小形态均一,绝大部分无蛋白残留,3.8×10~6个GEM颗粒样品中的DNA拷贝数仅为32;免疫印迹和荧光显微镜观察均可检测到融合蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP锚定在GEM颗粒上,且结合在GEM颗粒表面的锚定蛋白呈絮状。荧光分光光度计法检测结果显示锚定蛋白PA3-EGFP结合GEM的效率稍高于P60-EGFP,但差异不显著(P0.05)。以上结果表明由鼠李糖乳杆菌制得的GEM颗粒与锚定蛋白PA3、P60的结合效率良好,可用于构建新型的外源蛋白表面展示系统,进而为后续的细菌样颗粒疫苗的研究与应用奠定基础。     

HEVAg-PLGA纳米颗粒疫苗小鼠体内免疫学研究

研究重组戊型肝炎抗原(HEVAg)-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒抗原能否在动物体内诱导产生免疫应答。制备HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原后,通过皮下、滴鼻、口服途径接种Balb/c小鼠,每隔4周加强免疫两次,HEVAg与铝盐佐剂(铝佐剂疫苗Al_2O_3-Ag)为对照组,一定时间内检测抗体及细胞因子的应答水平。结果HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原在小鼠体内诱导产生有效的体液免疫、细胞免疫。滴鼻、口服途径黏膜系统中诱导产生较高滴度的IgA抗体,ELISPOT结果显示鼻腔、唾液腺中IgA ASCs数量显著增加;皮下途径诱导产生较高滴度的IgG抗体;常规铝佐剂疫苗相比于HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导较强的IgG抗体水平,未诱导产生黏膜免疫应答;HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导产生较强细胞免疫应答,皮下接种途径IFN-γ、IL-4生成细胞数量显著高于其它免疫组。与铝佐剂疫苗相比,HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原能有效诱导产生系统免疫及黏膜免疫应答,显示HEVAg-PLGA有潜力成为备选HEV黏膜疫苗抗原,同时展示PLGA颗粒作为黏膜系统抗原递送载体及黏膜佐剂的优越性。     

酵母表面展示酶技术

酵母表面工程是利用载体蛋白将外源蛋白以活性形式锚定于酵母细胞外表面,免去了外源蛋白的纯化和固定,并且对其有稳定作用。本文综述了酵母表面展示技术的原理、步骤、优点以及目前常见的酵母表面展示酶,如淀粉水解酶、纤维素水解酶、与木糖利用相关的酶、脂肪酶、有机磷水解酶的构建及应用。     

自转运蛋白作为细菌表面展示系统的研究进展CSCD

细菌表面展示技术已成功应用于生物技术、生物医药等诸多领域。在众多细菌表面展示系统中,基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统因其强大的外源蛋白展示能力,展现出良好的应用潜力和应用前景。本文综述了当前已发现的自转运蛋白的种类、已解析的自转运蛋白的结构及其分泌过程,概述了基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统的优点及其应用情况。     

枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白的研究

枯草芽胞杆菌孢子表面展示技术是最近十几年新兴的一种外源蛋白固定方法,已在酶学、疫苗学、靶向药物制备、金属污染治理等领域获得了广泛应用。以孢子衣壳蛋白为载体蛋白,已经成功地把许多抗原、酶和其他蛋白展示在孢子外表面。枯草芽胞杆菌孢子衣壳由多种衣壳蛋白组成,但可用做载体蛋白的并不多,且它们的特性不同。综合介绍了枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白这种新型技术的具体机理,及其在国内外各领域应用的研究进展。     

自转运蛋白作为细菌表面展示系统的研究进展

细菌表面展示技术已成功应用于生物技术、生物医药等诸多领域。在众多细菌表面展示系统中,基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统因其强大的外源蛋白展示能力,展现出良好的应用潜力和应用前景。本文综述了当前已发现的自转运蛋白的种类、已解析的自转运蛋白的结构及其分泌过程,概述了基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统的优点及其应用情况。     

基于冰核蛋白的乳酸菌表面展示系统的构建

[目的]验证来源于丁香假单胞菌的冰核蛋白在乳酸乳球菌表面展示外源蛋白的可能性.[方法]以绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)基因gfp为报告基因,以冰核蛋白基因的N末端和NC端作为展示单元,构建乳酸菌表面展示载体pHZ101和pHZ102,并转化大肠杆菌(Escherichia coli JM109和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363.[结果]荧光显微镜观察显示重组大肠杆菌和乳酸乳球菌均能检测到绿色荧光.Western blot结果表明GFP蛋白在重组大肠杆菌和乳酸乳球菌中均得到表达,并且INPN-GFP蛋白多数滞留于乳酸乳球菌细胞质内,而INPNC-GFP蛋白则大部分定位于乳酸乳球菌的细胞膜上.[结论]以上结果表明丁香假单胞菌的冰核蛋白能引导外源蛋白定位于乳酸乳球菌的细胞膜上,为乳酸菌表面展示系统的构建提供了新的方向.     

蛋白体黏膜佐剂的研究进展

通讯作者：蛋白体是脑膜炎球菌外膜蛋白形成的疏水性的毫微粒囊泡状结构,可以安全有效的提高脂多糖,蛋白和多肽等多种抗原疫苗的免疫原性。迄今为止,很多研究显示蛋白体黏膜佐剂的优势潜能。作者检索了近年来国内外关于蛋白体作为免疫佐剂的相关文献,并进行分析、归纳。本文综述了蛋白体的结构、作用机理以及国内外作为黏膜佐剂的研究进展。     

病毒样颗粒嵌合载体的研究进展

病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由病毒的一种或几种结构蛋白自行装配而成的类似天然病毒形态的空心蛋白颗粒。VLPs直径约20～200nm,具有规整的空间结构和良好的生物相容性,其表面有带有活性基团的氨基酸,可以作为嵌合载体递呈和展示同源或外源的表位抗原、肽和药物等各种材料。VLPs作为嵌合载体在新型疫苗、基因治疗、药物的靶向运输、造影等方面具有重要作用。本文对病毒样颗粒作为嵌合载体的国内外研究进展进行概述,为其进一步研究和利用提供参考。     

流感新型黏膜疫苗的研究

目的评价PorA、PorB和Class4对流感裂解疫苗的免疫增强作用,从中挑选出最有效的流感黏膜佐剂,为发展流感黏膜疫苗提供理论基础。方法流感三价裂解抗原按比例与PorA、PorB和Class4非共价结合,滴鼻免疫Balb／c小鼠3次,采取间接ELISA检测血清特异性IgG抗体及抗体亚型,检测鼻咽、肺、小肠和阴道冲洗液中IgA效价,采用血凝抑制试验检测血清中HAI效价。结果PorB重组蛋白佐剂组较无佐剂的流感裂解抗原组在提高小鼠早期免疫应答的同时诱导较强的系统免疫应答和黏膜免疫应答;PorA组也有黏膜佐剂的功能,但和无佐剂的流感裂解抗原组相比,差异无统计学意义。结论在蛋白体的三分子中,以PorB为佐剂的流感黏膜疫苗不仅提高了抗原的系统免疫应答,而且诱导了较强的小鼠呼吸道、生殖道的局部黏膜免疫应答,为流感黏膜疫苗的研制奠定了理论基础。     

人呼吸道合胞病毒G蛋白在大肠杆菌中的表达及联合不同新型佐剂免疫效果的研究

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus, hRSV）是导致5岁以下儿童和老人住院和死亡的主要原因。hRSV囊膜表面的融合蛋白F(Fusion protein, F)和吸附蛋白G(Attachment protein, G)均能诱导产生保护性中和抗体,但目前临床研究主要集中于F蛋白的亚单位疫苗及保护性单抗的研发,对G蛋白的研究较少。虽然G蛋白的高度糖基化导致其免疫原性较差,但使用佐剂能改善G蛋白的免疫效果。本研究利用大肠杆菌成功表达了hRSVA-Long株G蛋白膜外区67～298氨基酸（命名为REG）,并探索了REG与四种不同组合形式的新型佐剂联合免疫BALB/c小鼠的免疫效果：BFA03佐剂、B型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、C型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、BALB/c小鼠CD4+T细胞表位肽混合C型CpG OND和磷酸铝佐剂组合。对每只小鼠大腿肌肉多点注射100μL免疫原,初次免疫后第28天进行加强免疫。实验结果表明,接种REG联合新型BFA03佐剂的小鼠体内诱导产生结合抗体的能力最强,且其与接种REG蛋白联合B型CpG OND...     

乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展

乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌,被公认为安全级(generally recognized as safe,GRAS)微生物。近年来,对于乳酸菌作为宿主菌表达外源蛋白或抗原的研究取得了一定进展。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是乳酸菌的代表菌种,以其生长迅速、易于操作等优点成为表达外源抗原,作为黏膜免疫活载体疫苗的理想菌株。随着对乳酸乳球菌基因工程的研究逐渐深入,已发展了一系列组成型和诱导型乳酸乳球菌表达系统以及蛋白定位系统。破伤风毒素片段C、布氏杆菌L7/L12蛋白等多种病原微生物抗原已成功在乳酸乳球菌中表达,并已证明部分重组乳酸乳球菌作为黏膜免疫疫苗可以同时刺激局部黏膜免疫应答和系统免疫应答。目前,如何使活载体乳酸乳球菌以最佳方式向黏膜免疫系统提呈抗原继而诱导有效免疫反应是该领域的研究热点,也是巨大挑战。实现外源抗原在乳酸乳球菌中的准确定位及与细胞因子的共表达是未来研究的重要方向之一。乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递外源抗原具有广阔的应用前景。     

PPS纳米颗粒作为鼻内免疫的通用投递系统

<正>以聚丙烯硫化物为基本物质的可降解性多聚体纳米颗粒(NPs,50 nm)通过可逆的二硫键与硫化的抗原和佐剂蛋白结合,并评价其在黏膜免疫接种中的作用。以卵白蛋白作为模型抗原,结合了抗原的NPs鼻内免疫小鼠,作者证明,能穿透鼻黏膜,能被     

噬菌体展示技术及其在寄生虫研究中的应用

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的编码基因或DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达,并随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术.在研究蛋白质识别或蛋白质与核酸相互作用的生物学过程、蛋白质定向改造、研制新型多肽药物、疫苗和抗体等多领域具有重要作用.就噬菌体展示技术基本原理及特点,以及噬菌体展示技术在寄生虫研究中的应用做一简要综述.     

基于谷氨酸棒杆菌NCgl1221蛋白的新型细菌表面展示系统

【目的】开发一种新型的大肠杆菌表面展示系统,为C末端截短NCgl1221蛋白作为锚定蛋白提供科学依据,丰富并优化细菌表面展示系统。【方法】扩增C末端截短NCgl1221序列和β-淀粉酶基因,构建融合蛋白表达载体。将重组载体PET-NA和空载体PET-28a分别转入Rosetta(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白表达情况。将诱导表达菌株进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察和流式细胞分析检测β-淀粉酶的展示。酶活测定和淀粉水解分析验证被展示β-淀粉酶的活性。【结果】融合蛋白成功地在大肠杆菌中表达,有活性的β-淀粉酶通过与锚定蛋白C末端的融合被展示在了宿主菌表面,展示β-淀粉酶的重组菌可以水解利用培养基中的淀粉。【结论】成功开发了一种以C末端截短NCgl1221为锚定蛋白的新型大肠杆菌表面展示系统,并以此系统展示了分子量大小为56 kDa的活性酶,为该系统在全细胞催化剂或吸附剂等方面的应用奠定了基础。     

含乙型肝炎病毒S-PreS1 基因的DNA疫苗与蛋白颗粒疫苗联合免疫可增强免疫应答

为研制新型有效的HBV治疗性疫苗,构建了含PreS1与S融合基因的HBV DNA疫苗,即pVRC-HBSS1 (PreS1 21–47 aa融合在S抗原1–223的羧基端),并制备了CHO表达相同结构的蛋白颗粒亚单位疫苗HBSS1。在Balb/C小鼠中采用不同的DNA免疫方式 (即肌肉注射、皮内注射加电转) 初免3次,蛋白颗粒亚单位疫苗 (不同佐剂) 肌肉注射加强免疫1次,然后我们分析比较了各组疫苗所引起的免疫应答特点。抗体检测结果表明：皮内注射结合电转初免组产生的PreS1与 S特异性抗体水平皆高于肌肉直接注射组。进一步还发现DNA疫苗与蛋白颗粒亚单位疫苗两种疫苗联合应用后S抗原特异的细胞免疫应答 (IFN-γ ELISpot分析) 明显高于DNA疫苗或蛋白颗粒亚单位单独应用,其中皮内注射+电转结合蛋白颗粒亚单位疫苗联合免疫组可产生最强的细胞免疫应答。这些研究为新型HBV 治疗性疫苗的优化设计与合理应用提供了依据。     

利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽

S-层(S-layer)是由单一的蛋白或糖蛋白组成的薄层晶状结构,它广泛存在于古细菌和真细菌细胞的最外表面,可包裹整个细胞。S-层在结构化学、形态学、遗传学以及物理化学等方面具有独特的性质,使之在生物技术、分子纳米技术和仿生学等领域蕴藏着广泛的应用潜力。近年来,随着微生物表面展示技术的兴起和展示系统的逐渐成熟,继外膜蛋白、附屑结构蛋白、粘附蛋白以及凝集素等表面蛋白之后,S-层蛋白被作为一种新的表面展示载体成功的在细胞表面展示了一些外源大分子。多聚组氨酸肽是由若干个单位的六聚组氨酸串联而成的短肽。六聚组氨酸能够有效的吸附镍、镉等重金     

乳酸菌表面蛋白对免疫细胞的诱导增殖及粘附抑制效应

目的研究表面蛋白在乳酸菌体外粘附和激活免疫细胞中的作用。方法应用5mol/L氯化锂结合盐酸胍提取植物乳杆菌LpYZU09、干酪乳杆菌LcYZU02、鼠李糖乳杆菌LrGG、发酵乳杆菌LfYZU15及戊糖片球菌PpYZU32的表面蛋白,并分析提取物对乳酸菌粘附鼠肠上皮细胞、巨噬细胞和脾细胞的抑制作用及诱导增殖效应。结果表面蛋白对3种细胞粘附菌体均具有显著抑制效应,抑制作用具有细胞和菌株差异性,其中菌株LrGG表面蛋白对巨噬细胞粘附5种菌体普遍显示了较强的抑制作用,抑制率为38.7%~76.0%。不同菌株表面蛋白对肠上皮细胞的诱导增殖指数为0.05~0.35,对巨噬细胞为0.05~0.42,对脾细胞为0.02~0.40,诱导效应具有菌株和剂量依赖性,菌株LrGG的诱导增殖指数显著高于其他四种。结论乳酸菌表面的蛋白类因子在粘附和激活免疫细胞中发挥了重要作用。