湛江沿海潮间带产胞外纤溶活性酶类海洋真菌的生物多样性分析

【目的】研究湛江沿海硇洲岛和徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带产胞外纤溶酶样酶和纤溶酶原激活物海洋真菌的生物多样性,为发掘新型溶栓药物奠定基础。【方法】采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和酵母膏蛋白胨葡萄糖(YPD)培养基分离培养海洋真菌,采用真菌r DNA转录间隔区1-5.8S r DNA-转录间隔区2(ITS1-5.8S-ITS2)片段的序列分析及其系统进化树构建的方法鉴定分离培养的海洋真菌,采用脱脂牛奶马铃薯葡萄糖琼脂(SM-PDA)培养基培养法筛选产胞外蛋白酶的海洋真菌,采用海水纤维蛋白马铃薯葡萄糖琼脂(FN-PDA)培养基培养法筛选产胞外纤溶酶样酶和/或纤溶酶原激活物的海洋真菌。【结果】从湛江沿海的硇洲岛和徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带分离、培养和鉴定了海洋真菌446株,含真菌的98个种,分布于真菌域子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的6个纲、18个目、46个科、65个属;其中产胞外蛋白酶的海洋真菌有265株,61个种,分布于41个属;产胞外纤溶酶样酶的海洋真菌有67株,22个种,分布于14个属;产胞外纤溶酶原激活物的海洋真菌有84株,23种,分布于13个属;优势属为曲霉属(Aspergillus),其次为青霉属(Penicillium)。【结论】湛江沿海潮间带可分离培养的产胞外纤溶酶样酶和纤溶酶原激活物的海洋真菌物种丰富多样,是发掘新型溶栓药的丰富资源。     

不同海水浓度和培养时间对海洋真菌抗菌活性的影响

用滤纸片琼脂扩散法研究不同海水浓度和培养时间对海洋真菌抗菌活性的影响,旨在为大规模培养海洋真菌和提高获得抗菌物质的几率提供理论依据。结果显示：用不同海水浓度培养基发酵海洋真菌,在供试的10株海洋真菌中,5株海洋真菌的抗菌活性和抗菌谱有明显差异;培养时间不同,6株海洋真菌的抗菌活性差别较大。实验结果表明,不同海水浓度和培养时间对海洋真菌抗菌活性有显著影响。     

甲真菌病体外模型研究

目的 构建一个简单、经济的新的甲真菌病体外模型.方法 制备猪甲板,在其腹侧面中央黏贴一个“O”型圈,将受试菌液加入“O”型圈内,将甲板放置培养皿中培养,用大体观察及组织病理的方法动态观察不同真菌侵袭甲板的情况.结果 用猪甲板制备甲真菌病体外模型,通过该模型观察了红色毛癣菌、须癣毛癣菌以及白念珠菌穿透甲板的能力.通过组织病理学方法观察到了真菌动态穿透甲板的过程.结论 该模型适用于评估真菌对甲板的致病作用.     

冰核真菌胞外冰核产生条件、成冰生物学特性及其分离纯化的研究

果糖和葡萄糖作碳源、硫酸铵作氮源、培养温度25℃以下、培养液初始pH5～7和少量通气都利于胞外冰核产生,最佳培养时间受培养温度和接种菌龄的制约,而低温处理、光照及添加丝裂霉素C和HNPA对胞外冰核产生无明显影响。胞外冰核耐热(40℃处理后仍保持较高活性),酸碱适应性强(pH2～13);温度50℃以上、蛋白酶K和高浓度脲处理可完全失活或严重破坏其冰核活性,表明蛋白是真菌胞外冰核的必需成分;胞外冰核溶液中盐浓度高于50mmol/L时,活性才受抑制。25%冰乙醇可有效沉淀真菌胞外冰核,同时又保持较高活性;分离纯化的初步研究显示真菌胞外冰核分子量很大,电荷组成和分布上不均一,所带净电荷为负。本研究加深了对真菌胞外冰核的认识,为进一步分离纯化奠定了基础。     

冰核真菌胞外冰核产生条件、成冰生物学特性及其分离纯化的研究*

果糖和葡萄糖作碳源、硫酸铵作氮源、培养温度25℃以下、培养液初始pH5～7和少量通气都利于胞外冰核产生,最佳培养时间受培养温度和接种菌龄的制约,而低温处理、光照及添加丝裂霉素C和HNPA对胞外冰核产生无明显影响。胞外冰核耐热(40℃处理后仍保持较高活性),酸碱适应性强(pH2～13);温度50℃以上、蛋白酶K和高浓度脲处理可完全失活或严重破坏其冰核活性,表明蛋白是真菌胞外冰核的必需成分;胞外冰核溶液中盐浓度高于50mmol/L时,活性才受抑制。25%冰乙醇可有效沉淀真菌胞外冰核,同时又保持较高活性;分离纯化的初步研究显示真菌胞外冰核分子量很大,电荷组成和分布上不均一,所带净电荷为负。本研究加深了对真菌胞外冰核的认识,为进一步分离纯化奠定了基础。     

海水真菌定量分析方法的初步研究

为定量分析海水真菌,分别采用不同的采样方法采样;并采用5种培养基,每种培养基分别用4种不同的处理方式,共20种不同处理组合,筛选出适合定量分析海水中真菌的平板计数方案。结果表明,不同的采样方法下,真菌在同一培养基上的生长无显著性差异。在同一海水水样中,马铃薯培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基用海水配制时几乎没有真菌生长;麦芽汁培养基在不同的处理条件下真菌略有生长,且各种处理间无明显差别,其种类主要是霉菌;察氏培养基和酵母菌浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基在不同处理条件下真菌长势差别较大,种类主要是酵母菌。通过对20种培养组合的比较,选择酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,用海水来配制培养基并用海水稀释样品的处理,可以培养出最大数量的海洋真菌。     

红树林生态系统中不同生境不同深度土壤的可培养真菌的多样性

【目的】了解八门湾红树林生态系统中不同生境(潮间带、海洋到红树区的过渡带、海桑红树区)和不同深度土壤的可培养真菌的多样性。【方法】采用稀释涂布平板法分离土壤中的真菌,利用形态学观察和ITS rDNA序列分析技术研究可培养真菌的表观和遗传多样性。【结果】从八门湾红树林生态系统的3个不同生境中分离到257株真菌,分别属于21属28种,其中青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)为优势类群。来自不同生境或者同一生境不同采样深度的土壤真菌种类组成不同,并且有些真菌类群只出现在特定的样品中。从空间角度看,红树区土壤样品的真菌多样性高于其他两个生境的土壤样品;从垂直角度看,潮间带和过渡带的表层土壤样品的真菌多样性高于深层土壤样品,而红树区的深层土壤样品真菌多样性高于表层土壤样品。【结论】八门湾红树林生态系统中的可培养真菌资源丰富,种类多样性较高,但不同生境或不同深度的可培养真菌分布存在较大的差异。这些结果揭示了红树林土壤中可培养真菌的生态分布特点,也为红树林真菌资源的开发利用提供了基础的背景资料。     

冰核真菌胞外冰核产生条件、成冰生物学特性及其分离纯化的研究

果糖和葡萄糖作碳源、硫酸铵作氮源、培养温度25℃以下,培养液初始pH5-7和少量通气都利于胞外冰核产生,最佳培养时间受培养温度和接种菌龄的制约,而低温处理,光照及加丝裂霉素C和HNPA对胞外冰核产生无明显影响。胞外冰核耐热（40℃处理后仍保持较高活性）,酸碱适应性强（pH2-13);温度50℃以上,蛋白酶K和高浓度脲处理可完全失活或严重破坏其冰核活性,表明蛋白和真菌胞外冰核的必需成分;胞外冰核溶液中盐浓度高于50mmol/L时,活性才受抑制。25％冰乙醇可有效沉淀真菌胞外冰核,同时又保持较高活性;分离纯化的初步研究显示真菌胞外冰核分子量很大,电荷组成和分布上不均一,所带净电荷为负,本研究加深了对真菌胞外冰核的认识,为进一步纯化奠定了基础。     

长白山分解纤维素的瓶霉属和外瓶霉属真菌

瓶霉属、外瓶霉属真菌在自然界中广泛分布,是有着重要经济意义的一类真菌。迄今,我国已报道疣状瓶霉（Phialophoraverrucosa）、裴氏瓶霉（Ph.pedrosoi）、棘状外瓶霉（Exophialaspinifera）、皮炎外瓶霉（E.dermatitidis）和甄氏外瓶霉（E.jeanselmei＝Ph．gougerotii）5种,均是分离自人体的病原真菌。在长白山自然保护区的原始林中,用生长锥取样器随机钻取腐朽林木髓心,在实验室进行分离培养。共鉴定出瓶霉属真菌2种,外瓶霉属真菌3种,其中美州瓶霉（Ph.americana、烂木瓶霉（Ph．richardsiae）和鲑外瓶霉（E.salmonis）为国内新记录种。     

丛枝菌根真菌培养方法研究进展

文章结合最新研究成果着重从十个不同的层面对丛枝菌根真菌(AM真菌)的培养方法研究做了较为系统的介绍与评述。认为活体宿主植物盆栽培养法是最简单、最容易、也是最可靠的AM真菌培养方法,玻璃珠分室培养可方便地将培养基质与AM真菌分开,能获得纯净的AM真菌菌体,具有其它方法不可替代的作用,AM真菌单孢无菌的分室Ri T-DNA转型胡萝卜根双重离体培养是获得AM真菌纯净菌体和研究AM真菌遗传、生理、生化等特性的理想方法,以此方法为基础,在根室中补充碳源、在菌丝生长室置换培养基、多次收获菌体的转型根改良双重培养法是提高某些AM真菌孢子产量的力荐方法。     

降解全氟辛酸真菌的分离与鉴定

目的通过富集培养分离降解全氟辛酸(PFOA)的真菌,进行分类鉴定和降解特性分析。方法采集全氟化合物污染的土壤,利用以PFOA为唯一碳源的无机盐培养基进行驯化和富集培养,分离降解PFOA的真菌;通过形态观察和基于ITS基因序列的系统发育分析对分离菌株进行鉴定;采用LC-MS检测其降解PFOA的能力。结果分离获得2株降解PFOA的真菌AF1和AF2,初步鉴定分别为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)和棘卷枝毛霉(Mucor circinelloides);胞外酶活性分析均具有漆酶活性。真菌AF1和AF2在以PFOA为唯一碳源的无机盐培养基中培养72h后,最大降解率分别为24.24%和28.12%。结论自然环境中蕴藏着降解PFOA的真菌资源。     

国内首例威尼克外瓶霉引起的手腕掌黑癣并文献回顾

目的报道1例手腕部掌黑癣病例,并复习国内文献探讨该病的临床特征。方法 39岁男性患者,无明显诱因出现左手腕屈侧黑褐色斑疹1年,无自觉症状。刮取患处皮屑做真菌涂片、真菌培养和分子生物学检查进行确诊。结果临床怀疑为手腕部掌黑癣,真菌培养可见黑色圆形菌落,表面呈絮状,显微镜下可见厚壁有隔菌丝,大量圆形和椭圆形的棕色有隔孢子聚集在菌丝两侧和顶端,呈树枝状分布。分子生物学鉴定为威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)。予外用咪康唑联苯苄唑霜2周,每日2次,皮疹完全消退。结论掌黑癣常见于手掌,由威尼克外瓶霉引起的手腕掌黑癣国内首次报道。真菌培养可以初步诊断,基因测序能进一步明确菌种。     

一种观察真菌和制作封片的方法

用挑取的方法观察真菌形态构造和制作真菌封片,一般很难获得满意的结果。载片或盖片培养法和玻璃纸法的出现和应用,使情况得到了改善。但除少数方法外,大多操作比较麻烦,有的容易发生污染,有的效果稍差。现介绍一种十分简便的方法——“多盖片扦片祛”,它技术简单,不易污染,效果很好。在研究大量真菌标本或制作载片标本时尤为适用。     

未培养真菌分离培养方法初探

据估计自然界中真菌有220万到380万种,目前已经描述的真菌仅约12万种,不超过总数的8%。大量基于高通量测序的研究显示,自然环境中蕴藏的真菌多样性可能远远超出我们的预估。然而基于传统的分离培养技术的研究中,大量真菌却因难以获得纯培养而未被认知。因此探索新的真菌分离技术有助于提高我们对自然界中真菌多样性的认识,并获得可供开发利用的全新生物遗传资源。本研究以淡水湖底泥为调查对象,从优化培养条件和原位培养两个方面探索未培养真菌的分离培养方法,并与传统培养方法及免培养的高通量测序结果比较,评估各方法的分离效果。结果显示,低温分离显著影响获得的真菌组成,有利于嗜冷真菌的获得;无论在4℃低温还是25℃常温条件下,在培养基中添加维生素都能显著提高分离获得的真菌多样性,在属级水平上提高比例分别高达207%和81%。相较于传统25℃稀释平板法,基于分离芯片技术的原位培养在分离纯化效率、未知真菌捕获率以及物种多样性和均匀度等方面具有显著优势,显示原位培养技术在未来真菌分离培养中可能具有极大应用前景。     

外生菌根真菌利用碳素和氮素营养的研究

外生菌根真菌广泛地分布在森林土壤的表层。它们大部分属于担子菌纲,少数为子囊菌纲和半知菌类。据不完全统计,能形成菌根的真菌种类约有520种。分布在我国境内的约有160余种。因为这些真菌生长需要特殊的营养条件,因此能被人工分离培养的约有60种。其中有些在人工培培养基上虽生长,但不能长期保存。除非与树木根共生外,几乎不形成子实体菌根真菌纯培养菌在人工培养条件     

利用培养和免培养方法研究红壤的真菌多样性

利用培养和免培养方法研究了一个云南红壤的真菌多样性。扩增的18S rRNA基因片段经过RsaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ三种限制性内切酶消化后,培养方法共获得16种限制性酶切长度多态类型（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）,而免培养方法仅获得了12种RFLP类型。每个代表类型经DNA测序及系统发育分析表明,免培养方法得到的真菌全部属于子囊菌门。优势物种与Aspergillus niger类似,占免培养真菌的40．9％。其次是Penicillium属和Paecilomyces属真菌,分别占免培养真菌的18％和17％。此外,有13个克隆仅和环境克隆具有较近的亲缘关系。培养方法获取的真菌包括Ascomycota门（11．5％）、Zygomycota门（86．5％）以及Basidiomycota门（1．9％）真菌,优势克隆来自Mortierella属,占全部培养克隆的55．8％,有21．2％的序列与Absidia glauca相似。两种方法观察到的真菌物种完全不同。     

广州地区甲真菌病致病真菌的变迁趋势研究

目的为了解广州地区甲真菌病的致病菌种分布情况.方法笔者采用真菌培养法对临床症状典型或镜检阳性的甲真菌病病甲进行培养.结果分离出致病真菌618株,其中皮肤癣菌417株,占67.5%,酵母菌149株,占23.8%,霉菌54株,占8.7%.结论广州地区的甲真菌病的致病菌除皮肤癣菌外,酵母菌,霉菌也占一定的比例,近几年酵母菌感染有上升趋势.     

蒙古白丽蘑蘑菇圈土壤真菌多样性

通过2011—2012年间在呼伦贝尔市陈巴尔虎旗境内3个蒙古白丽蘑蘑菇圈样地的调查、采集和实验室研究,共分离得到蘑菇圈内、外可培养土壤真菌26属,其中圈上分离得到19属,圈外分离得到24属,圈上、圈外共有属17属。形态和分子鉴定确认特异性地存在于蘑菇圈上的土壤真菌有印度毛壳Chaetomium indicum Corda、花序棘壳孢Pyrenochaeta inflorescentiae Crous,Marinc.M.J.Wingf两种。7月1日到9月18日期间,蘑菇圈圈上与圈外土壤真菌数量变化趋势大体一致,但8月11日圈上的数量明显多于圈外。种类数目除了圈外在7月24日变化较大外,其余圈上和圈外均相对平稳。蘑菇圈外土壤真菌数量和种类随着土层加深呈减少趋势,但深度为7~14 cm的土层圈上土壤真菌数量大量增加,圈外的种类丰富于圈上。分析认为蘑菇圈抑制土壤真菌的种类,但对一些特定种类的生长有利,同时圆形闭合且活跃的蘑菇圈在一定程度上抑制土壤真菌的发生。     

香灰菌黑色素对真菌生长及多酚氧化酶活性的影响

以PDB培养的香灰菌丝体为材料,提取、纯化香灰菌黑色素,并测定香灰菌黑色素对六种真菌生长及对其胞外多酚氧化酶活性的影响.结果表明:香灰菌黑色素对六种真菌的生长没有抑制作用,而对其多酚氧化酶活力有明显的诱导作用.在不同的香灰菌黑色素浓度范围内,六种真菌胞外多酚氧化酶最大酶活的出现时间不同.     

培养容器容积对AM真菌生长发育的影响

研究宿主植物栽培容器对丛枝菌根(Arbuscularmycorrhizae,AM)真菌Glomusmosseae生长发育的影响。结果表明:小容积容器的根系密度相对较大,在菌根共生体建立初期,菌根真菌繁殖体与根接触的机会增大,对于菌根真菌的迅速侵染及共生体的迅速建立非常有利,同时还增大了根外菌丝二次侵染的机会,从而使菌根真菌生长发育形成了一个良性循环,最终有利于根外孢子的形成。容器对共生体的影响决不是简单的盆的体积问题,而与其面积和体积之比有关,也和种植密度有密切关系。