团褐固氮菌转导噬菌体AC-5.1的形态及其DNA的长度测量

圆褐固氮菌转导噬菌体AC一5.1为蝌蚪形,头部呈正六边形。尾部呈圆柱状,可自然弯曲。尾丝缠绕于尾端,使尾端呈倒钟状膨大。当尾丝散开后,表现为马尾状,倒钟状膨大消失。噬菌体吸附于寄主细胞的鞭毛上。噬菌体DNA白头部释放,DNA是双股的。DNA分子长度为17 03士0.18μm,根据经验公式得知,分子量约为3．6×10,道尔顿。     

圆褐固氮菌噬菌体AC-5.1的基本特性及其DNA分子量的测定

本文报道了圆褐固氮菌转导噬菌体AC-5.1的基本特性。它的寄主专一性很强,吸附速度常数K=5.26x10-9ml／min,潜伏期为90rain,裂解量为950噬菌体颗粒／细胞。它在pH6—11的范围内较稳定;在紫外线照射下30秒钟可失活90％;在热处理中,50℃失活90％需要1h,而60℃和70℃ lmin即可失活90％以上。提取了该噬菌体的DNA,通过原生质体转染试验,证明所提DNA具有重新形成噬菌斑的能力,经琼脂糖凝胶电泳的测定,该噬菌体DNA的分子量与噬菌体2．DNA的分子量相当。     

水稻根表固氮细菌的研究

作者对水稻根表固氮细菌的生态与分布进行了研究。分别从武汉大学、华中农业大学和湖北省农科院土肥所水稻田里采集水稻根系样品。研究了水稻根系固氮活性与作物生育期的关系。检测到水稻在抽穗期根系固氮活性最高,同时在此期间分离到的固氮菌株最多。不同碳源对同一根系的固氮活性也有影响。所分离获得的20株固氮细菌的纯培养经过鉴定分别属于Azospirillum brasilense和Klebsiella pneumoniae两个种。分别以R_(39)和R_(20)为代表株。     

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析*

用卡那霉素盒(Kmr-cassette)插入法,对巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的draTG基因及其下游区域进行了诱变,并获得相应的突变株。研究表明：draT变突株的固氨酶活性不再受铵抑制,而draG突变株在有铵时则丧失固氮酶活性,但当铵耗尽后却不能像野生型菌株那样恢复活性。draTG下游区域突变株YZ4(突变位点距draG约2kb)在无氮及限铵条件下,其固氮酶活性比野生型菌株的高,但其nifH-lacZ转录融合子的表达并不受影响,说明该区域可能有参与固氮酶活性水平调控的基因。     

固氮生物的类群

固氮生物有多种,一般都属于原核生物。通常都按照它们的固氮方式分成如下两大类。Ⅰ自生固氮生物 1.细菌(3目,11科,26属) (1)好气性细菌:棕色固氮菌(A.vinelandii),圆褐固氮菌(A.chrocoocum),贝氏固氮菌(A.beije—rinckii),活跃固氮菌(A.agile)等。     

在西红柿植株冠瘿中建立固氮体系初报

通过根癌农杆菌和圆褐固氮菌原生质体融合的方法,首次在非豆科植物(西红柿)上人工建立固氮体系。原生质体融合杂种 DF1.2具有固氮酶活性,把它接种在西红柿植株上可形成肿瘤,该肿瘤也具有固氮活性。     

肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用

固氯螺菌(Azospirillum)是一类仅在限铵和微好氧条件下固氮的微生物,它可与许多禾本科作物联合共生⑴,具有较大的应用潜力。铵作为固氮作用的调节信号,在固氮螺菌的实际应用中是首要的限制因素。在固氯螺菌中,铵不但具有与肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)相似的阻遏固氮酶合成的作用,而且还对已合成的固氮酶进行活性调节⑵。研究表明,其固氮酶翻译后活性调节的机制类似于深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)⑶,即在有铵条件下其固氮酶铁蛋白的一个亚基被共价修饰而丧失活性,这一过程是可逆的。由于铵在固氮螺菌中双水平地调节固氮作用,使得在野生菌株中研究其固氮基因表达水平上的调节较为困难。Zhang等⑷利用区域定位诱变技术获得了巴西固氮螺菌Sp7（A．Brasilense Sp7)的draT-突变株,在该突变株中铵不再影响固氮酶的活性,这为其固氮基因表达调节的研究提供了一个良好的材料。本文将组成型表达的肺炎克氏杆菌nifA基围引入该突变株中,通过分析讨论铵对巴西固氮螺菌固氮基固表达的调节作用方式。     

异源nifAC对根癌土壤杆菌nif基因表达的调节作用

三亲交配方法分别将载有褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)呈组成型表达的nifAC的质粒pCK5和肺炎克氏杆菌(Kldosiella pneumoniae)含有nifAc和nifA—ntrc基因的质粒pcK3．pSZ36和pSZ23-CA导入根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciem)C58／pGV3850,所得转移接合子的生长速率和野生型相似。在10mmol／L,NH₄⁺浓度下,Western blotting测出A．Tumefaciens C58／pGV3850(pCK5)有固氮酶合成,乙炔还原法测定固氮酶活性恢复分别为73％．24％,11％和62％。这些结果表明,褐球固氨菌和肺炎克氏杆菌的固氮调节基因对土壤杆菌同氮基因表达有调节作用。其中．褐球固氮菌nifAc的调节功能最强(73％),其次是肺炎克氏杆菌nifA和nrrC的融合子(62％),肺炎克氏杆菌nifAc的调节功能较弱(24％。11％)。     

万古霉素产生菌抗噬菌体突变株的选育

在万古霉素的生产过程中,发现菌丝体突然自溶,经噬菌斑检查,证明是噬菌体侵染所引起的。用噬菌体或噬菌体、紫外线复合处理敏感菌株东方链霉菌(Streptomycesortentalis) 3746,得到抗噬菌体突变株72-4-863、72-5-1077和72-6-1306,产万古霉素的单位也较敏感株3746提高500一1000单位／毫升。     

荚膜红细菌的分离鉴定及其协同固氮作用

从上海南汇县的水稻根系中分离得到一株光合固氮菌ＳＤＨ２,经形态、细胞膜结构、生理生化等特征的分析鉴定,以伯杰细菌鉴定手册第九版和ＪＦＩｍｈｏｆｆ的光合硫细菌和绿硫细菌的生理学和分类^［１］一文为依据,确定该菌为荚膜红细菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ。同时,发现该菌与水稻根表的其它固氮菌之间具有协同生长和协同固氮效应。     

几种固氮菌nifA基因片段的同源性分析

参照已知数种固氮菌nifA基因的DNA序列,选择其中间区域的两个保守性较强的序列合成引物,利用肺炎克匠杆菌(Klebsiella pneumoniaef)、棕色固氮菌(Azotobacter vinela-ndii)、巴西固氮螺菌(Azospirllum brasilense)、草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)和深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的总DNA进行聚合酶链反应,结果均扩增出约450bp大小的片段,经证实为各种固氮菌的nifA基因部分片段。 核酸印迹分子杂交结果显示出nifA基因在不同固氮菌中的同源性不强。     

肠杆菌膦酸酯代谢途径中phnF基因的研究

大肠杆菌的phn操纵子与膦酸酯(Pn)的利用密切相关。实验利用PCR扩增、TA克隆等方法．获得了大肠杆菌phn操纵子中phnE、phnF和phnG基因的亚克隆,并进行了序列测定。通过P1噬菌体转导,构建了phnF的TnphoA’-9转座子插入突变体JW19,该突变仅对大肠杆菌的AEPn同化有微弱的影响,而利用phnE和phnG序列与染色体重组构建的phnF全缺失突变株JW67,则几乎不能在．AEPn培养基上生长。通过phnF基因的诱导高表达,用亲和柱层析分离纯化了PhnF。蛋白,达到电泳纯。并且用凝胶延滞的方法观察到,PhnF蛋白与加phn操纵子DNA片段相互作用后,可使凝胶图谱类型发生改变。     

固氮螺菌耐高铵突变株的选育

应用亚硝基脏(N-nitrosoguanidine,NTG)诱变剂对固氮螺菌菌株Ma241、Ma99、Sp7和G14进行诱变处理后,在掭加了铵的类似物乙撑二胺(ethyleae diamina)的D6bcreiner无氯培养基中进行筛选．反复纯化,获得了在4 5 n、M NH}浓度以上,保持固氯酶活性的耐铵突变株共9株。突变株22的耐铵固氮酶活性最强,在75mM NH+4浓度下,固氮酶活性达到464n mol乙烯／mg蛋白·小时,在200m M NH+4浓度下,固氯酶话性仍有32nmol/mg蛋白·小时。     

利用微生物混合培养技术生产聚羟基烷酸(PHA)研究

研究了圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)突变株G3与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)G6发酵生产聚羟基烷酸(PHA)的人工可配伍性,确定了它们混合培养的适宜条件,先将G3菌株发酵培养24～28 h后,再以15%(v/v)接种量接入G6菌株并同时补加05%(g/g)蛋白胨(FP)和0.5%(g/g)NH4NO3,继续混合培养42～46h,细胞干重达32 g/L,PHA含量为80%,再结合补料技术最终生物量可达53 g/L,PHA产生量达42.4 g/L。糖对PHA的转化率为0.32。人工混合培养成功地解决了固氮菌发酵生产PHA过程中,发酵液粘度过高,传质较差,补糖总量上不去等技术问题。     

稻根联合固氮细菌的研究II．粪产碱菌A-15和阴沟肠杆菌E-26的固氮特性

用乙炔还原法、总氮测定法和15N同位素示踪法证实了从水稻根分离的两株固氮菌,粪产碱菌(Alcaligenes faecalis) A-15和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) E-26,具有较强的固氮 能力。A一15是徽好氧固氮菌,利用苹果酸、乳酸、琥珀酸等有机酸作为碳源,在无氮的半固体培养基中生长和固氮良好,乙炔还原活性可达500—700毫克分子C2H·／毫升培养物／小时。E一26是兼性厌氧菌,只有在严格厌氧条件下才有较明显而又稳定的固氮能力。在无氮的蔗糖培养基中,乙炔还原活性为200一如0毫克分子ctH·／毫升培养物川、时,当A一15和E一26混合培养时,两菌表现出协同的固氮作用,周氮量剧增,乙炔还原活性可提高至1000一1500毫克分子 C2H4／毫升培养物／小时。     

白喉毒素的双重溶原性转换的研究

从白喉噬菌体β和r杂交,分离得到一株白喉噬菌体的重组子一、具有亲代噬菌体β产生毒紊的溶原性转换能力,即带有β的毒素基因(tox)和噬菌体r的溶原性免疫性的特征。该噬菌体再感染单溶原性产毒菌株C7(β),得到双重溶原性菌株,携带了两个前噬菌体及其所带有的两个毒素基因,菌株产毒能力单溶原性亲代株高。     

巴西固氮螺菌中P_Ⅱ和P_Z在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌 (Azospirillumbrasilense)中 ,glnB和glnZ是两个高度同源基因 ,分别位于 3 7kb EcoRI+PstI和 3 7kb SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒 (Kmr cas sette)插入法 ,对glnB和glnZ分别进行定位诱变 ,并获得相应的突变株 ,即glnB- 和glnZ- 。研究表明 ,glnB- 突变株丧失固氮酶活性 ,表现为Nif- ,而glnZ- 象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能 ,将glnB和glnZ分别构建在pVK1 0 0载体上形成重组质粒pVK -Ⅱ和pVK -Z ,对glnB- 和glnZ- 突变株进行互补实验 ,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性 ,而glnZ无此作用。同时 ,通过三亲接合法将pVK -Ⅱ和pVK -Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT- 突变株中 ,使glnB和glnZ的拷贝数增加 ,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因 ,能显著提高固氮酶活性 ,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时 ,将pVK Ⅱ和pVK -…     

钾长石矿区土壤固氮菌的多样性分析

目的分离纯化钾长石矿区土壤中高效固氮菌,并分析其固氮菌的多样性。方法采集湖南省吉首市钾长石开采区土壤,采用纯培养法分离固氮菌,通过形态特征观察、生理生化特征和基于16SrDNA基因序列的系统发育分析初步鉴定固氮菌的种属关系,采用凯氏定氮法测定固氮菌的固氮能力,筛选高固氮能力菌株。结果分离获得28株固氮细菌,共10个属,其中4株固氮能力较强的细菌,编号分别L5、L6、L10、L13,经初步鉴定,分别为Burkholderia、Enterobacter、Bacillus、Rhizobium,进一步的研究结果表明菌株L13固氮能力最强,固氮量为10.71mg/L,是对照组的51倍。结论从钾长石矿区土壤中分离到的固氮菌具有多样性,并能获得较高固氮能力的细菌,为复合型解钾、固氮菌的研究积累素材,同时为挖掘高效复合型固氮微生物,提供参考和提供资源。     

浑球红细菌谷氨酸合酶基因(glt)的克隆和图谱分析

利用转座子Tn5随机插入诱变筛选得到12株浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)氨同化缺陷突变株(Asm~-)。这些突变株胞内均无GOGAT活性,同时它们均无固氮酶活性(Nif~-),并且具有氮代谢多效性缺失表型(Ntr~-)。将含有Azorhizobium sesbaniae ORS571的完整glt基因的质粒pHB10转入突变株中能互补上述表型。通过筛选携带Tn5的R-prime质粒克隆了glt::Tn5片段。Southern杂交证明所克隆glt::Tn5片段与E. coli的gltBD基因有同源性。用此片段与以pLAFR3为载体所构建的R. sphaeroides 601基因文库进行菌落原位杂交筛选到了携带glt基因的cosmid pLT27。pLT27能互补所有12株R.sphaeroides氨同化缺陷突变株。酶切分析表明在该cosmid中插人的染色体DNA片段大小约为26.5kb。以pRK415为载体亚克隆了4.0kb与10.5kh的pLT27的Hindlll酶切片段,分别命名为pLTRK271与pLTRK272。pLTRK272能互补变种GT6、GT10、GT11,pLTRK…     

固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系III．转座子Tn5诱变的 Azospirillum brasilense 吸氢活性缺陷株的筛选

以携带有自杀性质粒pR64：：Tn5的大肠杆菌(E．Coil RL29)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌W251-10(Azospirillura brasilense W251-10)进行杂交,在选择性平板上测得卡那霉素抗性菌落与受体菌菌落之比为5．0x 10-7。受体菌W251-10的卡那霉素抗性自发突变频率小于1.14×10-9。经气相色谱仪分析测得一株丧失吸氢酶(Hydrogen Uptake Hydrogenase)活性的突变株(编号为 Azospin llum brasilense WG15),同时发现其固氮酶(Nitrogenase)话性也已丧失。 DNA分子点杂交结果表明,所获得的突变株WGl5的总DNA中存在有’n5的序列,而w251—10呈阴性结果,从而证实了WGl5吸氢活性的丧失是由于Tn5在DNA中的插入引起的,同时也揭示了巴西固氯螺菌的吸氢酶基因(缸p)和固氮基因(nr,) 在遗传学上有着连锁的关系。