红曲霉葡萄糖淀粉酶的研究III．葡萄糖淀粉酶两个分子型的比较

红曲霉(Monascus sp.)AS 3.3491的葡萄糖淀粉酶具有多型性,将其中主要的两个分子型F,和E4 提纯到凝胶电泳均一制品,并进行了比较研究。其氨基酸组成相似,差别最大的足丝氨酸,桕差6个残基,其次是精氨酸,差3个残基,其他氢基酸柑同或相差少于2个残基。氨基末端均为天冬氨酸和丝氨酸,羧基术端为酪鲺酸。两型酶都是糖蛋白,含糖量稍有差别,E,为7％,E4 为9％。其组成单糖以甘露糖为主,萁次是半乳糖,还有痕量的木糖和葡萄糖。两型的分子量也很接近。根据氨基酸残基计算,Sephadex G-100 凝胶过滤和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测出的数值均在54,000左右。 两型的等电点(pl)差别也很小,E3 为4.00,E4为4.10。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的研究I．提纯和结晶

红曲霉的葡萄糖淀粉酶具有多形性。经聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳可分离为几个距离很近的带,暂定为带1、2、3、4和5。酶制剂浸出液经硫酸铵盐析,凝胶过滤脱盐和DEAE一纤维紊柱层析,初步得到两个冼脱部分。部分I以带4为主,部分II以带3为主。两部分均提纯约2-5倍,收率合计27％a将部分I或II用硫酸铵沉淀出酶蛋白,再用逐步降低浓度的硫酸铵溶液在0℃抽提,然后在7屯放置数周,在盐饱和度为56、54、52％的抽提液中均出现结晶,结晶为针状,井聚成麦捆状、放射状或球状晶簇。长径可达50一100微米。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的研究II．进一步提纯及其性质

红曲霉(Monascus sp．) AS 3．2199的葡萄糖淀粉酶(E．C．3．2．1．3)的凝肢电泳图谱表现为5个带。过去曲经提纯得到过以带3和带4为主的制品。结晶的样品仍具有两个带。现将DEAE一纤维素柱层析的条件加以改变,即以0．01M、pH5.8的吡啶一盐酸缓冲液及NaCl浓度梯度(0—0．2M)洗脱,可以得到以带4为主的制品,经在同样条件下再层析即得到凝歧电泳均一的纯带q样品。纯酶作用的最适条件为pH4.5,温度50—55℃。耐热性较差,在55℃保温5小时后,酶活力仅存13％。酶作用于可溶性淀粉的米氏常数K。为1．05×10-4(克／毫 升)。Ag+、Fe++、8-羟基喹啉和碘乙酸对酶有抑制作用。用等电聚焦法测定出来的等电点pI为4．04(5—7℃)。紫外吸收光谱最高吸收值在282毫微米,最低吸收值在252毫微米。超离心沉降分析表现为均一样品,样品浓度为10毫克／毫升时测得的沉降?占数sw,20为5．55s,浓度0．27毫克／毫升时,测得的Sw,20为4．8S。用凝胶过滤法在Sephadcx G 100柱上测出分子量为55,000。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的底物特异性

红曲霉（Monascus sp.）As 3.3491的葡萄糖淀粉酶具有多型性,其中的两个主要组分 E3和 E4得到了凝胶电泳均一的样品。比较了它们的底物特异性,同时与粗酶液和未分纯的 E3+4作了比较。从酶对底物的分解限度来看,粗酶液能100%的分解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、玉米淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糖和麦芽三糖,也能分解茁霉多糖（Pullulan）（35.8%）,潘糖（Panose6-α-葡糖基麦芽糖）（27.3%）、异麦芽糖（9.6%）、右旋糖酐（5%）、龙胆二糖（1.9%）。纯北的 E3和 E4仅能100%地分解糖原,麦芽糖和麦芽三糖,对其他底物的分解限度则有不同程度的降低,E3,E4和 E3+4之间没有明显差别,可以看出粗酶液中有能分解α-1,6-糖苷键的酶存在。各种酶样品均不能分解环状糊精（α,β和γ）,纤维二糖、龙胆二糖和（?）糖。比较了各种酶样品对不同底物包括不同平均链长的糊精的反应初速度,在用同样的百分浓度下,对麦芽糖、麦芽三糖、支链淀粉,可溶性淀粉等的反应初速度高,而对直链淀粉的反应初速度要低得多,这与它没有分枝,非还原性末端较少有关。对不同平均链长的小分子糊精的反应初速度随着链长的增加而增加。而对异麦芽糖的水解速度仅相当于麦芽糖的1%左右,E3,E4和 E3+4之间无明显的差别。用麦芽糖和可溶性淀粉为底物,比较了 E3和 E4的 Km 值和 Vmax值。两种酶对麦芽糖的Km 值均为1.38×10-1（%）,对于可溶性淀粉的 Km 值均为1.05（%）,Vmax也基本相同。E3和 E4对可溶性淀粉的水解产物均为β-葡萄糖,两种酶均能催化葡萄糖合成少量寡糖。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶肽段P_A的提纯及性质的研究

红曲霉葡萄糖淀粉酶能水解淀粉产生葡萄糖。我们已对它进行了提纯、结晶,及电子显微镜观察,并测定了它的一些基本性质。该酶的两个主要分子型E_3和E_4的肽图谱绝大部分是相同的,只有个别肽段不同。我们用胰凝乳蛋白酶水解红曲霉葡萄糖淀粉酶的两个型,两者的产物中都有一个P_A肽段,其凝胶电泳迁移率和纸层析R_f值相同。本文报道我们用垂直板型凝胶制备电泳及凝胶层析法提纯P_A肽段,并对其性质进行的研究结果。     

亲和层析法分离胆固醇氧化酶

利用胆固醇氧化酶和底物胆固醇之间的亲和力,以胆固醇为吸附剂构成底物亲和层析柱.发酵液经盐析、透析后直接进行亲和层析.研究了洗脱液A和B的流速、洗脱液B中表面活性剂的浓度,确定了适合的层析条件,使比酶活从0.45U/mg提高到15.5U/mg.     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶形成过程的研究

红曲霉(Monascus sp．)的葡萄糖淀粉酶具有多型性。比较了原始菌株AS3.978及其变异株AS3．2199及AS3.3491所产生的葡萄糖淀粉酶的凝胶电泳图谱,证实了三者所产生的主要区带E3和F4是互相对应的。     

影响红曲霉葡萄糖淀粉酶活力的因子

本文报道了某些化学试剂对红曲霉葡萄糖淀粉酶两个分子型E3和E4活力的影响。在试验的十六种金属离子中,Fe²⁺、Co¹⁺、Ca²⁺、Mg²⁺ 稍有激活作用(+20％),重金属离子Hg²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺ 和 Fe³⁺ 有不同程度的抑制作用(一20一40％),Ag+ 则是一个强烈的抑制剂(一80％)。     

纯化小麦α-淀粉酶的亲和层析法

纯化α-淀粉酶有多种方法。Mac Gregor等以及Kruger和Tkachuk分别应用羧甲基纤锥素离子交换层析与丙酮分部、糖元沉淀和离子交换层析,各自从大麦及春小麦分离了α-淀粉酶。Tkachuk又发展了以α-环化糊精为配基的α-淀粉酶分离纯化的亲和层析法。由于亲和层析法简便、快速、高效,因而获得了广泛的应用。我们以β-环化糊精(β-Cyclodextrin)为配基,分离纯化了小麦α-淀粉酶。现介绍如下。     

SPA亲和层析法提纯HBsAg的初步研究

自六十年代中期Blumberg发现HBsAg以来,乙型肝炎的研究取得了许多重大进展。检测HBsAg的方法越来越敏感。然而不管是建立新的敏感检测方法,还是进一步研究HBsAg的生物学特性,都需要纯化的HBsAg。目前提纯HBsAg常用琼脂糖亲和层析法和超速离心法。两者均要求较高的设备和技术条件,前者还需接触剧毒药品溴化氰,在中小实验室不易推广使用。本文介绍一种采用SPA作载体的改良亲和层析法,从血清中分离提纯HBsAg。该法经济简便,较易掌握,效果理想,重复性好,     

红曲霉AS 3.3491葡萄糖淀粉酶形成的研究

对红曲霉AS3．3491供给易利用碳源,葡萄糖淀粉酶的形成受咀遏,cAMP可使之解阻遏。易利用碳源的迅速利用使培养液pH显著下降,实验发现各种提高培养液pH值的方法都能促进葡萄糖淀粉酶的形成。同时发现该菌株的五种类型的葡萄糖淀粉酶是随培养液pH的逐渐回升陆续形成的,且各型酶的出现都与培养液的一定pH值相关联。文中讨论了该菌株中葡萄糖淀粉酶形成的调控机制。     

亲和层析法分离腺苷结合蛋白质

本文报告一种新的腺苷亲和层析凝胶的合成方法。利用这种凝胶可从大鼠心脏、肝脏及小牛主动脉平滑肌的水溶部份分离出几种腺苷结合蛋白质,其亚基分子量(据SDS-PAGE)分别为35,000、37,000、46,000、43,000及15,300Dal。现已证明,35,000Dal蛋白质是乳酸脱氢酶及苹果酸脱氢酶,43,000Dal蛋白质是腺苷激酶,46,000Dal蛋白质可能是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。15,000Dal蛋白质前人未有报道。它对腺苷具有高度特导性和亲和力,推测是腺苷的细胞内受体和/或载体。测定了这种低分子量腺苷结合蛋白质的氨基酸组成及某些物理常数:pI=6.5;沉降系数2.42S,微分比容0.727cm~3/g,与腺苷复合物的解离常数K_D=2.3μM。     

以淀粉珠为载体的亲和层析法分离纯化高温α淀粉酶

 以淀粉珠为载体的亲和层析法分离纯化高温α淀粉酶张学忠,宋伦,王群,吴晓霞,唐锌进（吉林大学酶工程国家重点实验室,长春１３００２３;南京师范大学生物系,南京２１００２４）金凤燮等人从酒曲中筛选出高产热稳定α淀粉酶的菌株,命名为Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ－ＪＦ...     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的紫外差光谱的研究

红曲霉葡萄糖淀粉酶(EC3 2．1．3)在凝胶电泳上呈现3--5个极为接近均具有酶活性的区带,测定了其中主要的两个分子型E,和E．的紫外吸收特性,它们在水,pH5．0酷酸缓冲液,pH7．0柠檬酸缓冲液中吸收光谱十分接近,吸收峰均在Z80am。 E,在水溶液中280am时8=11．3 x104,A==20．4,E．在水溶液中280rim时8=11．0×104Ai==20．0,E3和E4在0.1NNaOH中吸收均增强且峰位红移,在0.1N HCI中吸收峰略为蓝移。测定了E,和E．在pH 3．1和pH 3．6时的温度差光谱,在pH 3.1 E,和E. AA变化极小,在pH 3.6,E,比E．△A变化大,但转变温度E,和E．都在56℃左右。E,和E．酪氨酸光谱滴定行为极为接近,其pK值在11．5左右。测定了E,pH差光谱和变性差光谱,以pH 2．66为参比溶液,在pH 3.55、4.65、7.14及7．84可以见到酪氨酸和色氨酸的差吸收峰。8M尿素和6M盐酸胍均能使E,出现酪氨酸和色氢酸的负的差吸收峰。