高产紫杉醇菌株的诱变选育及其差异表达基因消减cDNA文库的构建

[目的]选育高产紫杉醇菌株,并构建选育到的高产紫杉醇菌株与出发菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库.[方法]分别采用硫酸二乙酯和紫外线与硫酸二乙酯复合诱变处理菌株HD1-3孢子;以选育到的高产紫杉醇菌株为tester,菌株HD1-3为driver,应用抑制性消减杂交技术构建选育到的高产紫杉醇菌株与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库.[结果]试验确定的Nodulisporium sylviforme紫杉醇产生菌HD1-3孢子复合诱变的适宜条件为:将106cfu/mL孢子悬液经过8%硫酸二乙酯处理15 min后,在电磁搅拌下,用紫外灯(30 w,距离30 cm)照射处理45 s,获得了1株遗传性状稳定、高产紫杉醇的突变株--UD14-11,其紫杉醇产量从出发菌株HD1-3的232.73±4.61μg/L提高至312.81±7.51μg/L;构建的文库滴度为1.2×107cfu/mL,阳性克隆率75.3%,片段大小主要集中在300 bp-1.0kb.[结论]选育到了1株遗传性状稳定、高产紫杉醇突变株;成功地构建了高产紫杉醇菌株UD14-11与菌株HD1-3差异表达的cDNA消减文库,为寻找、分离微生物生物合成紫杉醇相关基因和利用基因工程或代谢工程手段定向设计改造菌株奠定基础.     

一株产紫杉醇罗汉松内生真菌的分离和鉴定

[目的]紫杉醇是重要的抗癌药物,主要从罗汉松等植物中提取,为了保护罗汉松等种质资源,本文从罗汉松植株中分离产紫杉醇内生真菌,并对内生真菌所产紫杉醇的抗肿瘤活性进行了分析.[方法]采用组织块法自罗汉松的根、茎、叶等组织中分离内生真菌;通过四唑蓝(Methyl ThiazolylTetrazolium,MTT)比色法筛选有抗肿瘤活性的内生真菌菌株,通过薄层层析(Thin Layer Chro-matography,TLC)和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)对内生真菌所产活性物质进行鉴定;采用抽提法抽提内生真菌所产紫杉醇,应用Vero细胞对抽提的紫杉醇的活性进行了分析.[结果]从罗汉松属(Podocrapus)植物中分离到155株内生真菌,其中28株内生真菌具有较高的抑癌活性.将其中一株菌株A2命名为EPTP-1,经形态学和分子分类学分析鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus).菌株EPTP-1中抽提的紫杉醇5.553μg/L～555.3 μg/L作用24h表现出明显的致细胞凋亡作用.菌株EPTP-1发酵5天时紫杉醇的产率为0.5578±0.0294 mg/L.[结论]从罗汉松中分离到了一株产紫杉醇内生真菌EPTP-1,可作为紫杉醇类药物工业化生产的候选菌株.     

1株产紫杉醇内生真菌LNUF014的鉴定及产物检测

从红豆杉的韧皮部组织中分离得到的360株内生真菌中,通过对发酵粗提的检测,共筛选到11株产紫杉醇的真菌。其中1株内生真菌LNUF014的发酵液采用有机试剂抽提紫杉醇,经薄层层析和高效液相色谱分析,初步表明该菌株的紫杉醇类物质含量为53.68μg/L。根据形态学研究和真核生物18S rDNA基因序列分析,将其鉴定为镰刀菌属(Fusarium)。产紫杉醇内生真菌的研究将对紫杉醇类抗肿瘤药物的研制具有重要意义。     

深黄被孢霉发酵生产γ-亚麻酸的研究

以深黄被孢霉AS 3.3410(Mortierella isabellina AS 3.3410)的变异株M_6为出发菌株,γ—亚麻酸含量210mg/L,经紫外线和微波处理得到变异株M_(6-22),摇瓶发酵γ-亚麻酸含量1181mg/L,200升发酵罐发酵γ-亚麻酸含量达到1350mg/L。对200升罐发酵的后提取工艺进行了研究,以乙醇和正己烷分步抽提效果最好。脲素包合法的实验结果表明,在70～75℃、3h的条件下可以使γ-亚麻酸由7.2％浓缩到72％。     

微生物发酵产生的番茄红素的分离纯化

研究了三孢布拉霉(Blakeslea trispora)发酵产生的番茄红素的分离纯化方法。与植物源的番茄红素相比,真菌发酵产物中含有更多的油脂成分,且提取物中含有的一些同分异构体与产物性质类似而不易分离。实验采用溶剂抽提、大孔吸附树脂吸附法纯化以及结晶的方法可获得番茄红素晶体,纯度达70.9%,收率为64.6%。产品经重结晶后可获得纯度90%以上的番茄红素,经红外、核磁、质谱等证实与植物来源的番茄红素相一致。     

银杏内生真菌Aspergillus oryzae YX-5抗肿瘤活性物质的分离与鉴定

【背景】植物内生真菌是天然活性物质的重要来源。【目的】对一株具有抗肿瘤活性的银杏内生真菌米曲霉Aspergillus oryzae YX-5进行活性物质的分离与鉴定。【方法】将该菌株发酵培养后,发酵液经乙酸乙酯萃取,采用减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱分析,从其代谢产物中分离活性化合物,在分离过程中以MTT法跟踪检测分离到的各组分及纯化合物的抗肿瘤活性。【结果】从菌株YX-5的发酵产物中分离纯化得到4个化合物。经核磁共振和高分辨质谱分析,将其分别鉴定为羟基曲霉酸(1)、环(4-羟脯氨酸-苯丙氨酸)(2)、环(亮氨酸-苯丙氨酸)(3)和环(丙氨酸-苯丙氨酸)(4)。其中羟基曲霉酸对人宫颈癌HeLa细胞具有显著的细胞毒活性,其IC_(50)为1.07μg/mL。【结论】报道羟基曲霉酸在抗肿瘤方面的活性,表明米曲霉及羟基曲霉酸在抗肿瘤天然产物开发中具有一定的应用潜力。     

一株银杏内生真菌代谢产物的初步研究

从银杏树皮内侧分离纯化获得6种类27株内生真菌。使用TLC、HPLC、HPLC/ESI-MSn方法对上述真菌胞内代谢产物进行研究,最终发现1株真菌菌株G3B经发酵后产生银杏内酯B等成分。经形态学初步鉴定该菌株为镰孢菌属(Fusarium)真菌。     

黄山地区红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离和筛选

从黄山地区红豆杉中分离得到107株内生真菌,利用薄层层析(TLC)方法对107株内生真菌的发酵代谢物进行了初筛,首次筛出8株可产紫杉醇或其类似物的菌株。再通过高效液相色谱(HPLC)对其作了进一步分析,发现有1株内生真菌菌株发酵代谢物的吸收峰与紫杉醇标准品吸收峰保留时间一致。同时结合以中国仓鼠卵巢CHO细胞株作为肿瘤细胞模型,用Resazurin法检测生长抑制率,对经筛选出的1株内生真菌次生代谢产物进行体外抗肿瘤活性试验,该菌株的代谢物对CHO细胞的抑制率高达71.28%。通过对该菌株的显微形态观察,从菌丝、孢子的形态和产孢子的特征等初步判定HQ-24是曲霉(Aspergillus sp.)。     

真菌降解β-胡萝卜素的产香研究

从采自云南红河的31份烟草样品中分离筛选到5株可降解β-胡萝卜素的真菌,结合菌株形态及ITS序列分析对菌株进行分类鉴定。初步鉴定菌株YNCA9801为产黄青霉(Penicillium chrysogenum),YNCA9802为黄柄曲霉(Aspergillus flavipes),YNCA9803为枝孢霉(Cladosporium lignicola),YNCA9804为米曲霉(Aspergillus oryzae),YNCA9807为橘青霉(Penicillium citrinum)。菌株YNCA9804降解β-胡萝卜素可获得具果香味的发酵产物,样品通过GC-MS分析,发酵产物含有2-庚醇、2-壬酮和二氢猕猴桃内酯的致香物质。     

葡萄孢属一新种

通过对紫杉醇产生菌HD104的培养研究,确定了HD104菌株的分类地位,为葡萄孢属一新种——红豆杉葡萄孢(Botrytis taxi D．P．Zhou,W．X．Ping et Y．Wang sp．nov)。新种有拉丁文描述并附图,模式标本(HD104)保存于黑龙江大学微生物实验室(The Microbiology Lab of Heilongjiang University,HUML)。     

产紫杉醇内生真菌TMS-26的分离和鉴定

为丰富产紫杉醇植物内生真菌资源库,从曼地亚红豆杉Taxus media茎中分离得到一株产紫杉醇的内生真菌TMS-26。通过对TMS-26的发酵提取物进行高效液相色谱分析,发现其具有与紫杉醇标准品(4.545 min)相近的色谱特征峰。进一步通过液质联用仪检测发现,内生真菌TMS-26的发酵提取物中具有与紫杉醇标准品((M+Na)+=876)相近的质谱特征峰,表明内生真菌TMS-26能够产生紫杉醇。同时通过传统形态学分类鉴定方法和18S r DNA序列分析、Internal-transcribed spacer(ITS)序列分析等现代分子生物学分类鉴定方法,最终将内生真菌TMS-26鉴定为曲霉属烟曲霉Aspergillus fumigatus,并命名为"烟曲霉TMS-26"。     

Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling

To apply the fundamental principles of genome shuffling in breeding of taxol-producing fungi, Nodulisporium sylviform was used as starting strain in this work. The procedures of protoplast fusion and genome shuffling were studied. Three hereditarily stable strains with high taxol production were obtained by four cycles of genome shuffling. The qualitative and quantitative analysis of taxol produced was confirmed using thin-layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and LC-MS. A high taxol producing fungus, Nodulisporium sylviform F4-26, was obtained, which produced 516.37 μg/L taxol. This value is 64.41% higher than that of the starting strain NCEU-1 and 31.52%–44.72% higher than that of the parent strains.     

Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling

To apply the fundamental principles of genome shuffling in breeding of taxol-producing fungi, Nodulisporium sylviform was used as starting strain in this work. The procedures of protoplast fusion and genome shuffling were studied. Three hereditarily stable strains with high taxol production were obtained by four cycles of genome shuffling. The qualitative and quantitative analysis of taxol produced was confirmed using thin-layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and LC-MS. A high taxol producing fungus, Nodulisporium sylviform F4-26, was obtained, which produced 516.37 μg/L taxol. This value is 64.41% higher than that of the starting strain NCEU-1 and 31.52%―44.72% higher than that of the parent strains.     

从中国红豆杉细胞培养物中分离鉴定紫杉醇

中国红豆杉(Taxus chinensis(Pilger．)Rehd)细胞在培养过程中合成了紫杉醇,我们利用固液分离、大孔吸附树脂吸附富集、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、低压硅胶柱层析、重结晶等方法,从中国红豆杉的细胞培养物中分离纯化了紫杉醇,用多种核磁共振波谱方法(^1H NMR,^13C NMR,DEPT,^1H-^1H-COSY,NOESY,HMQC,HMBC)结合质谱(FABMS),红外光谱、紫外光谱等方法鉴定了它的化学结构,证明与源于天然红豆杉植物材料提取的紫杉醇为同一物质。     

产紫杉醇内生真菌Z58的分离和鉴定

本研究从曼地亚红豆杉（Taxus x media）树皮内表皮分离得到一株产紫杉醇的内生真菌Z58,通过高效液相色谱法、质谱法和核磁共振波谱法对其紫杉醇提取物进行了分析. 结果表明,内生真菌Z58的紫杉醇提取物具有和紫杉醇标准品相近的色谱特征峰,其保留时间为10.2 min;也与紫杉醇标准品具有相同的质谱特征峰（（M+Na）+=876）和1H-NMR谱带.并通过形态学特征分析和18S rDNA序列分析,将内生真菌Z58初步鉴定为肉座菌属（Hypocrea sp.）真菌.肉座菌Z58的紫杉醇产量约为2.5～3.0 μg/g（紫杉醇/菌丝干重）,是一株具有潜在应用价值的产紫杉醇内生真菌.     

南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei)植株分离到内生真菌63株,其中24株经鉴定分属于19个种(属).真子囊菌纲的2个属2株,半知菌纲的14个属22株.真子囊菌纲的无毛毛壳属(Achaetomiumsp.)的1株为新发现种.半知菌纲的葡萄孢属(Botrytissp.)1株和无孢菌群(Mycelia sterlia)2株的培养液,经浓缩萃取,薄层层析检测,Rf值分别为0.404、0.404、0.401,与紫杉醇对照品Rf值一致,为南方红豆杉产紫杉醇内生真菌.     

Survey of aflatoxin-producing fungi in certain fermented foods and beverages in Thailand

Aflatoxin-producing fungi were found in fermented foods and beverages: fermented rice (kaomak), soybean sauce (taotjo), peanut butter, soy sauce (shoyu), Thai red and white wine, and rice sugar wine. These foods were extracted directly and tested for aflatoxins by thin-layer chromatography (TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC).Four strains of aflatoxin-producing fungi were isolated from peanut butter, taotjo, and shoyu. Direct extracts of 10% of the peanut butters tested and 5% of the kaomak tested contained large amounts of aflatoxins. The HPLC procedure used in this experiment utilized chloroform-ethyl acetate (31)     

蝉虫草（蝉花）来源的化合物鉴定与抗菌活性检测

蝉虫草（蝉花）是我国重要的传统中药材之一,用于治疗慢性肾炎等,但对其活性成分的研究仍不充分。本文采用硅胶柱、凝胶柱、ODS柱分离,以及HPLC等色谱技术,对蝉虫草子实体样品的乙酸乙酯提取物进行分离纯化,得到3个化合物。根据波谱学数据,化合物1-3分别鉴定为(E,E)-9-酮-10,12-十八碳二烯酸(E,E)-9-oxooctadeca-10,12-dienoic acid（1）、麦角甾醇ergosterol（2）和白僵菌酮bassiatin（3）,其中化合物1为首次从蝉虫草中分离获得。抑菌实验表明,3个化合物均对革兰氏阴性大肠杆菌Escherichia coli和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有显著的抑菌活性,化合物1和3还对条件致病真菌白色念珠菌Candida albicans有明显的抑菌活性。本文的研究结果丰富了蝉虫草的活性化合物组成。