转录因子WRKY6和PR1在拟南芥胁迫记忆中的表达模式

植物暴露在细菌或其它微生物病原体下,会形成全身防御,称为系统获得性抗性SAR（Systemic Acquired Resistance）,该系统可以在病原体二次侵染时有效抑制病原体对植物的伤害。其中,WRKY转录因子和病程相关蛋白PRs（Pathogenesis-related proteins）在植物抗病信号调控途径中起着重要作用。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,对WRKY6和PR1（PATHOGENESIS RELATED）两个转录因子进行初步研究。首先,从拟南芥eFP数据库中获得WRKY6和PR1的基因表达数据,进行生物信息学分析,获得WRKY6和PR1基因在不同胁迫条件下的表达热图。其次,通过实时荧光定量PCR技术,比较了经过生物胁迫和非生物胁迫处理后WRKY6和PR1的基因表达水平。结果表明,拟南芥经过生物胁迫丁香假单胞菌[Pseudomonas syringae pv.tomato（P_st） DC3000]处理后,WRKY6和PR1的基因表达模式具有一定的相似性,然而经过非生物胁迫和机械损伤组合处理后,WRKY6和PR1基因又呈现出不同的表达模式。本研究初步探索了WRKY6和PR1基因的表达模式及其关系,为今后进一步研究系统性获得抗性应答机制提供了思路。     

拟南芥ASL25/LBD28基因过量表达对叶片形态建成的影响

为研究ASL25/LBD28基因在植物发育过程中的作用,该研究构建了拟南芥ASL25/LBD28的过量表达载体并将其转入野生型拟南芥中,结果发现,ASL25/LBD28基因的过量表达可导致转基因拟南芥的叶片变得狭长;在叶极性发育突变体as2中,ASL25/LBD28基因过量表达导致部分转基因植株在形成1～3片畸形叶后顶端分生组织的发育会终止;而许多转基因植株则会形成许多"针状"叶.扫描电镜观察表明,不正常的叶片近轴面或"针状"叶的表皮细胞具有远轴面化的长条形细胞,说明在as2突变体中过量表达ASL25/LBD28基因影响叶片的极性发育.     

谷胱甘肽转移酶基因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长

盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因(glutathione s-transferase gene,GST)克隆到植物表达载体pROKⅡ35s启动子的下游,通过农杆菌介导,利用花絮浸泡法转化拟南芥.转化子在含有卡那霉素的培养基上经过筛选以后,将初步验证为阳性的转基因植株通过PCR-Southem进一步证实.经过选育,筛选并分离到卡那霉素的抗性并且遗传稳定的T3代纯合子转基因拟南芥品系.通过Northern杂交证实外源基因在转基因拟南芥中表达.在盐胁迫条件下,通过测量转基因植株(GT)和野生型植株(wY)的生物量和谷胱甘肽(氧化型:GSSG;还原型:GsH)发现:转基因植株的生物量较野生型有一定程度的提高;GssG含量在转基因品系中比野生型的含量明显高.因此,过量表达GsT能够提高转基因植株在盐胁迫条件下的生长,而且这很可能是由于还原型谷胱甘肽被氧化的结果.     

过量表达棉花GaSus3基因增强拟南芥的耐盐性

构建了植物过量表达载体p35S：：GaSus3,通过花序浸染法成功获得转GaSus3基因拟南芥植株。利用NaCl模拟盐胁迫处理,证实转基因拟南芥与野生型相比耐盐性明显增强。在盐胁迫下,转基因拟南芥受到的影响较小,而野生型则受盐害影响严重：转基因拟南芥具有更好的萌发率和主根长度,以保证植株正常生长;盐胁迫下转基因拟南芥能保持较多的绿色叶片,而野生型则过早黄化死亡。研究还发现,转基因拟南芥的过氧化氢酶活性在胁迫前后都高于野生型,这说明转GaSus3基因能够提高拟南芥抗氧化胁迫的能力。研究结果为进一步探讨GaSus3基因在棉花耐盐方面的功能奠定了基础。     

拟南芥AtLH基因过量表达引起叶向下性卷曲和晚开花

AtLH基因是BcpLH基因在拟南芥(Arapsis thaliana L.)中的同源基因,含有两个编码双链RNA结合蛋白的结构域.在大白菜叶球发育过程中,BcpLH基因与包叶的卷曲有关.为研究AtLH的基因对叶卷曲这一重要生物学现象的调控作用,构建了35S:AtLH基因的正义表达载体并转化拟南芥.与野生型比较页言,转基因植株的花和叶中AtLH的表达量有显著增加,成为AtLH基因过量的植株.这些植株的莲座叶向外或向下卷曲,呈现明显的偏上性生长;而且抽苔和开花时间延迟;在营养生长期其短缩茎的叶腑处着生数个侧茎,表现为顶端优势减弱;在生殖生长期二级花序减少使得主花序更加发达,表现为顶端优势增强,转基因植株对激素的敏感性改变,IAA剌激根生长的作用增强,ABA抑制根生长的作用减弱.由此可见,AtLH基因的过量表达可引起转基因植株的叶片向下卷曲.     

马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式

马铃薯WRKY2基因的功能尚未见有报道,WRKY蛋白是近年来发现的一类重要转录因子家族,它们在植物应对生物胁迫、非生物胁迫和生长发育过程中起到关键的调控作用。该研究采用电子克隆法获得马铃薯WRKY2基因,该基因的编码区长度1 065 bp,编码355氨基酸,序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第二组成员,锌指结构为C-X5-C-X23H-X-H。构建系统发育树结果表明它与番茄WRKY7亲缘关系较近,氨基酸序列相似性达96%,与烟草中WRKY蛋白的相似性为86%,利用原核表达法在大肠杆菌中获得该蛋白。通过凝胶阻滞实验证明,该蛋白在体外能结合W-box元件,而且这种结合能被冷探针所竞争,同时也表明St WRKY2不能结合含有突变W-box DNA片段,证明St WRKY2与W-box结合具有特异性。通过实时荧光定量PCR技术分析该基因在根、茎和叶中的表达量,结果表明该基因主要在根中表达,其次是叶和茎。为进一步研究该基因可能参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行10μmol/L低磷、10μmol/L低钾、200 mmol/L Na Cl、400 mmol/L PEG溶液和4℃低温处理,处理时间6 h,实时荧光定量PCR的结果表明该基因在低磷处理后表达量明显下降,在200 mmol/L Na Cl和400 mmol/L PEG处理6 h后表达量明显升高,但在10μmol/L低钾和4℃低温处理后表达量与对照相比无明显变化。说明St WRKY2能响应低磷、Na Cl和PEG这三种非生物逆境胁迫。研究结果可为进一步深入研究马铃薯WRKY2基因的功能奠定基础。     

番茄LeNHX1基因植物过量表达载体的构建及表达分析

从番茄幼苗中提取RNA,根据NCBI中番茄LeNHX1基因序列设计引物,通过RT-PCR获得了番茄LeNHX1基因的cDNA序列,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。将cDNA序列连接到植物过量表达载体PBI121上,对所获得的重组质粒进行双酶切鉴定,结果表明,植物过量表达载体PBI121-LeNHX1已构建成功。半定量RT-PCR结果表明LeNHX1基因在根、茎和叶中均表达,盐、低温和脱落酸的诱导能提高LeNHX1基因的表达量,推测番茄LeNHX1基因在逆境应答中可能起着重要作用。     

过量表达拟南芥CAT提高烟草对气体甲醛的吸收和抗性

为提高植物对甲醛的吸收和耐受,利用拟南芥CAT的编码区构建植物过表达载体pk2-Prbc S-*T-CAT,在野生型(WT)烟草叶绿体中过量表达CAT产生2个表达量不同的转基因株系(C1、C3)。用10ppm、20ppm和40ppm气体甲醛处理WT和转基因烟草,分析过量表达CAT的转基因烟草对甲醛的吸收效率和耐受性。结果表明,转基因烟草对气体甲醛的吸收量明显高于WT,且随着处理浓度的升高,转基因株系叶片的可溶性总糖、总蛋白质和总叶绿素含量都显著高于WT;转基因株系叶片氧化损伤指标H202、丙二醛(MDA)和羰基化蛋白(PC)的含量都显著低于野生型。转基因烟草(C1)的PM H+-ATPase和氢泵活性在40ppm处理后为WT的3倍和2.5倍,C1的气孔导度为WT的2.67倍。这些结果表明,在烟草中过量表达拟南芥CAT能降低甲醛进入烟草细胞引起的氧化损伤,提高烟草对甲醛的脱毒能力,增强烟草对甲醛的吸收和抗性。揭示气体甲醛胁迫时质膜H+-ATPase和氢泵活性影响叶片气孔的导度,这可能是转基因烟草甲醛吸收效率提高的原因之一。     

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。     

拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000表达模式分析及过量表达转基因植株获得

植物体内的α,β-不饱和活性醛类化合物对植物细胞具有毒害作用,清除这些α,β-不饱和活性醛类化合物对于植物细胞维持正常的生命活动至关重要。前人研究报道通过体外酶活测定和异源瞬时表达鉴定拟南芥 At3g04000基因编码的蛋白为 NADPH 依赖的叶绿体醛还原酶(Arabidopsis NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases, AtChlADRs),推测其在清除叶绿体中长链(≥5)α,β-不饱和醛类物质中具有重要的功能。该研究主要构建了拟南芥 At3g04000基因的表达模式分析载体 ProAt3g04000：GUS、亚细胞定位分析载体At3g04000-EGFP 和过量表达载体 At3g04000-OE,并获得了转基因拟南芥,并通过实时定量 PCR 分析了At3g04000基因在拟南芥不同组织中的转录水平。结果表明：拟南芥 At3g04000基因在幼苗中的转录水平最高,在莲座叶、茎生叶、花序和角果中均有较高的转录水平;而在根部和茎秆中的转录水平较低。通过对ProAt3g04000：GUS 转基因植株的 GUS 染色分析可知,At3g04000基因在子叶、莲座叶和萼片的维管组织和保卫细胞中均有较强的表达,在根的维管组织中有较弱的表达。通过共聚焦显微镜对 At3g04000-EGFP 转基因植株的观察和分析发现,At3g04000不是定位于叶绿体中,而是定位在细胞质和细胞核中。该研究结果为深入研究拟南芥醛还原酶编码基因 At3g04000的功能奠定了基础。     

APETALA1突变影响WRKY基因的基础表达

拟南芥APETALA1（AP1）既是一个花分生组织特征基因又是一个花器官特征基因,在花器官发育中控制花萼和花瓣的发育。通过GUS染色进一步证实AP1主要在茎尖、花萼、花瓣和花托的位置表达。启动子分析发现,AP1启动子区包含了包括W-box在内的大量顺式作用元件,暗示相关转录调控因子参与了对AP1的调控。21个WRKY基因单突变后并不改变AP1在花中的表达,但是AP1突变则增强了检测的10个WRKY基因中7个WRKY基因的表达,暗示AP1参与了对WRKY基因的基础表达的调控。这个结果也暗示AP1可能通过控制花萼和花瓣的发育从而参与了对花的基础抗性。     

The Conserved PFT1 Tandem Repeat Is Crucial for Proper Flowering in Arabidopsis thaliana

It is widely appreciated that short tandem repeat (STR) variation underlies substantial phenotypic variation in organisms. Some propose that the high mutation rates of STRs in functional genomic regions facilitate evolutionary adaptation. Despite their high mutation rate, some STRs show little to no variation in populations. One such STR occurs in the Arabidopsis thaliana gene PFT1 (MED25), where it encodes an interrupted polyglutamine tract. Although the PFT1 STR is large (∼270 bp), and thus expected to be extremely variable, it shows only minuscule variation across A. thaliana strains. We hypothesized that the PFT1 STR is under selective constraint, due to previously undescribed roles in PFT1 function. We investigated this hypothesis using plants expressing transgenic PFT1 constructs with either an endogenous STR or synthetic STRs of varying length. Transgenic plants carrying the endogenous PFT1 STR generally performed best in complementing a pft1 null mutant across adult PFT1-dependent traits. In stark contrast, transgenic plants carrying a PFT1 transgene lacking the STR phenocopied a pft1 loss-of-function mutant for flowering time phenotypes and were generally hypomorphic for other traits, establishing the functional importance of this domain. Transgenic plants carrying various synthetic constructs occupied the phenotypic space between wild-type and pft1 loss-of-function mutants. By varying PFT1 STR length, we discovered that PFT1 can act as either an activator or repressor of flowering in a photoperiod-dependent manner. We conclude that the PFT1 STR is constrained to its approximate wild-type length by its various functional requirements. Our study implies that there is strong selection on STRs not only to generate allelic diversity, but also to maintain certain lengths pursuant to optimal molecular function.     

拟南芥AtLH基因过量表达引起叶向下性卷曲和晚开花(英文)

AtLH基因是BcpLH基因在拟南芥(Arabidopsis thealiana L.)中的同源基因,含有两个编码双链RNA结合蛋白的结构域。在大白菜叶球发育过程中,BcpLH基因与包叶的卷曲有关。为研究AtLH基因对叶卷曲这一重要生物学现象的调控作用,构建了35S:AtLH基因的正义表达载体并转化拟南芥。与野生型比较而言,转基因植株的花和叶中AtLH的表达量有显著增加,成为AtLH基因过量表达的植株。这些植株的莲座叶向外或向下卷曲,呈现明显的偏上性生长;而且抽苔和开花时间延迟;在营养生长期其短缩茎的叶腋处着生数个侧茎,表现为顶端优势减弱;在生殖生长期二级花序减少使得主花序更加发达,表现为顶端优势增强;转基因植株对激素的敏感性改变,IAA刺激根生长的作用增强,ABA抑制根生长的作用减弱。由此可见,AtLH基因的过量表达可引起转基因植株的叶片向下卷曲。     

Causes of Flowering of Long-Day Potato Species under Short-Day and Cold-Night Conditions

Flowering and tuber formation in high-mountain potato species Solanum sparsipilum Bitt., S. acaule Bitt., S. punae Juz., S. demissum Lindl., and a tuber crop Ullucus tuberosus Caldas. were investigated. All these species are characterized by absolute requirement of long day-length for flowering and short day-length for tuberization. Plants were grown under the following conditions: natural day-length with a photoperiod of 17 h or longer (treatment 1), short days with a photoperiod of 12 h and warm nights (15–20°C) (treatment 2), and short days with cold nights (5–6°C) (treatment 3). In the first treatment, plants produced flowers but no tubers. In the second treatment, plants produced tubers but no flowers. In the third treatment, plants produced both flowers and tubers. In leaves of S. acaule and U. tuberosus, the levels of gibberellins and ABA were determined. A high activity of gibberellins in the third treatment was similar to that in the first treatment, whereas high ABA activity in the third treatment was similar to that in the second treatment. It is supposed that cold nights retard the destruction of GA in plants during the dark period of diurnal cycle and ensure a permanently high level of gibberellins, which facilitates flowering of long-day species under short-day conditions. The high level of ABA is considered a plant response to short-day conditions, which is favorable for tuberization.     

拟南芥开花时间调控的分子基础

在合适的时间开花对大多数植物的生存和成功繁衍极为重要。开花时间受错综复杂的环境因素和植物自身的遗传因子影响,由开花调控因子所构成的光周期、春化、温度、赤霉素、自主以及年龄等至少6条既相互独立又相互联系的遗传途径调控。该文综述了有关拟南芥(Arabidopsis thaliana)开花时间调控的分子机制的最新研究进展,并对今后的研究进行了展望。     

亲环素AtCYP1 RNA干涉载体的构建及对拟南芥发育的影响

根据拟南芥AtCYP1基因序列设计特异引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtCYP1基因中344 bp转录本,插入表达载体PTCK303,构建目的基因RNA干扰载体Ubi::AtCYP1i。利用改良的农杆菌浸染技术获得拟南芥RNAi转基因株系,RT-PCR分析结果表明转基因株系中AtCYP1基因的表达量低于野生型,表型观察结果表明RNAi转基因纯合株系抽苔时间比野生型晚3.32 d,抽苔叶片数较野生型多2.49片,其开花时间、结出第一个种荚的时间、株高等方面也与野生型存在明显差异。此结果说明AtCYP1可能参与了拟南芥的早花发育过程,为进一步研究其在植物生长发育中的功能奠定了基础。