用于DNA无性繁殖的EcoRI接头的化学合成

利用二酯法化学合成了一个脱氧八核苷酸(d-G-G-A-A-T-T-C-C)。此八核苷酸片段自身互补形成双链DNA片段,能被限制性内切酶EcoRI酶解。利用双向同系层析测定了它的核苷酸序列,证明这一片段的序列符合实验设计要求。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)先后同d-_pT_pC~(An)_pC~(An)_(-CA(?))和d-_pG~(Bz)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_(OAc)反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-GpApCpGpApGpTpCpCpG_pGpApA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸 d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)_pT_pC~(An)_pC~(An)_pG~(Bz)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基-纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)T_p~(Bz)C_p~(An)C_p~(An)G~(Bz*)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基一纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)先后同d-_pT_pC_p~(An)C_(OAc)~(An)和d-pG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_(OAc)~(Bz)。反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-G_pA_pC_pG_pA_pG_pT_pC_pC_pG_pG_pA_pA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅣ.EcoRI 接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI 接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA 连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

多核苷酸合成的研究 ⅩⅣ.EcoRI接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(M8)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)和d-_(MMTr)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An))*,脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-G_pA_pC_pG_pA_pG和d-T_pC_pG_pA_pA_pC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5′端或3′端(例如d-_pG_p~(Bz)A_(ODMTr)~(Bz))。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)和d-(MMT_r)T_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)),脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-GpApCpGpApG和d.TpCpGpApApC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5’端或3’端(例如如d-_pG~(Bz)_pA~(Bz)_(-ODMT_r))。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅳ.用改进的二酯法化学合成d-pCpCpCpA

用改进的二酯法化学合成了几个脱氧寡核苷酸片段(d-pCpC,d-pCpCpC,d-pCpCpCpA)。改进的主要之点是:(1)全部脱去保护基后柱分离,以克服在柱分离时寡核苷酸的保护基引起的亲脂性;(2)对所需的寡核苷酸片段重上适当的保护基,以作下一步的合成之用,于是避免了原先二酯法的操作中保护基的不希望有的丢失。用改进二酯法获得的寡核苷酸,产率和纯度得到提高和改善。虽然此改进目前仅用来合成寡核苷酸短片段,但可能提供用3’-5’磷酸二酯键方式连接两天然DNA短片段的途径。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅳ.用改进的二酯法化学合成d-pCpCpCpA

用改进的二酯法化学合成了几个脱氧寡核苷酸片段(d-_pC_pC,d-_pC_pC_pC,d-_pC_pC_pC_pA)。改进的主要之点是:(1)全部脱去保护基后柱分离,以克服在柱分离时寡核苷酸的保护基引起的亲脂性;(2)对所需的寡核苷酸片段重上适当的保护基,以作下一步的合成之用,于是避免了原先二酯法的操作中保护基的不希望有的丢失。用改进二酯法获得的寡核苷酸,产率和纯度得到提高和改善。虽然此改进目前仅用来合成寡核苷酸短片段,但可能提供用3′-5′磷酸二酯键方式连接两天然DNA短片段的途径。     

多核苷酸合成的研究——改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸 d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-_(an)C 或d-_(ib)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩合,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz)(?)T(?)T(?)C~(An)A~(B(?))(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)(?)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的结果。     

多核苷酸合成的研究——Ⅶ.RNA连接酶合成十六核苷酸(CpUpCpGpUpCpCpApCpUpCpGpUpCpCpA)

~(32)pCUCGUCCA(作为供体),CUCGUCCA(作为受体),其比例为1:50,在RNA连接酶催化下,进行连接反应,形成16核苷酸片段即CUCGUCCA~(22)pCUCGUCCA。反应后产物经Sephadex G-75柱分离,分离后得到的产物通过下列鉴定:抗碱性磷酸单酯酶;同系层析;毗邻分析等。证明是我们所希望的产物,其产率经过重复在50～70%之间。这种RNA连接酶对合成具有一定排列顺序的RNA片段,可以认为将是一种很好的工具酶。     

耐热DNA多聚酶的研究与开发

PCR法的发明与耐热DNA多聚酶的应用 DNA多聚酶已广泛应用于基因探针的切口平移标记,双链DNA上的5′单链末端的填补或3′末端标记,cDNA互补链的合成,双脱氧法测定碱基序列以及体外专一性诱变等分子生物学方法。而耐热的DNA多聚酶至少在两个应用领域中比一般DNA多聚酶有其特殊的作用:其一是在体外扩增特定的基因;其二是在DNA核苷酸顺序分析中能消除高级结构的影     

EcoRI限制性内切酶底物专一性的研究——具有核糖修饰的EcoRI底物类似物的合成

本文报道用化学和酶促相结合的方法合成了d-GGArATTCC和d-GGArATTC。酶促反应结果说明,当受体3′末端为核糖核苷时大大促进RNA连接酶的作用。产物的结构均经蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳-同系层析双向图谱鉴定得到证明。这两种类似物都能被EcoRI限制性内切酶识别并在专一位置上水解,结果说明EcoRI的识别顺序中第四位上d-A变为r-A并不显著影响酶的识别,而且证明了EcoRI的最小底物是含有识别顺序的七聚脱氧核苷酸。     

EcoRI限制性内切酶底物专一性的研究——具有核糖修饰的EcoRI底物类似物的合成

本文报道用化学和酶促相结合的方法合成了d-GGArATTCC和d-GGArATTC。酶促反应结果说明,当受体3'末端为核糖核苷时大大促进RNA 连接酶的作用。产物的结构均经蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳一同系层析双向图谱鉴定得到证明。这两种类似物都能被EcoRI 限制性内切酶识别并在专一位置上水解,结果说明EcoRI 的识别顺序中第四位上d-A 变为r-A 并不显著影响酶的识别,而且证阴了EcoRI 的最小底物是含有识别顺序的七聚脱氧核苷酸~*。     

胰岛素B链中肽段的合成 Ⅵ.N-端八肽衍生物的合成

胰岛素B链N-端八肽衍生物,卽cb·phe·val·asp(NH_2)·glu(NH_2)·(im-Bz)his·leu·(S-Bz)cys·gly·OC_2H_5,曾用cbz·(im-Bz)his·leu·OH与H·(S-Bz)cys·gly·OC_2H_5借DCCI缩合生成cbz·(im-Bz)his·leu·(S-Bz)cys·gly·OC_2H_5,然后经溴化氢的冰醋酸溶液脱去苄氧羰基后,依次与cbz·glu(NH_2)·ONP,cbz·asp(NH_2)·ONP,cbz·val·ONP和cbz·phe·ONP缩合生成。此外,该八肽衍生物还曾用cbz·phe·val·ONP和B_(3—8b)缩合或cbz·phe·val·asp(NH_2)·N_3和B_(4-8b)缩合生成。所得八肽经溴化氢的冰醋酸溶液脱去苄氧羰基后,能为氨肽酶完全消化。     

寡聚脱氧核苷酸的结构与抗降解特性的研究

合成了４段具有不同高级结构或不同修饰的寡聚脱氧核苷酸,检查它们在２０％血清中的稳定性．发现：（１）寡核苷酸主要被血清中的３′外切核酸酶降解,未经修饰的线性寡核苷酸降解严重;（２）末端部分硫代修饰的寡核苷酸稳定性明显提高;（３）自身互补形成的配对结构可有效保护３′末端．具有４个以上（含４个）ＧＣ对的３′端发夹结构寡核苷酸,其抗核酸酶的能力几乎与硫代修饰的寡核苷酸相当．     

多核苷酸合成的研究 改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-(an)C或d-_(tb)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩台,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz_(?)T(?)T(?)C~(An)A~(Bz)(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的结果。     

多核苷酸的合成与研究——Ⅴ.一种由3′端向5′端延伸的脱氧寡核苷酸的化学合成与抽提分离的新方法

化学合成特定顺序的DNA片段,目前除广泛采用三酯方法外,对二酯方法的合成与分离也作了不少的研究。为了用抽提法制备5′端带磷的片段,有些实验室曾采用三苯甲基苯硫乙醇、三苯甲基对胺基苯酚及三苯基苯胺等来保护5′端磷酸基,但这些磷酸上的保护基脱落条件比较复杂,产物回收也不够理想,抽提分离的片段长度一般在二核苷二磷酸。本文则用DMT选择性地保护5′核苷酸的3′羟基,抽提制备了脱氧二核苷二磷酸dpG~(BZ)pA~(BZ)-ODMT和脱氧四核苷四磷酸dpC~(An)pG~(Bz)pG~(BZ)pA~(Bz)-ODMT片段。