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目的:为了探索构建第三代复制依赖性腺病毒载体系统的有效实验方法,利用细菌内重组原理,分别构建了第三代腺病毒生产体系中的辅助性腺病毒和表达Cre重组酶的真核表达载体,并分析了Cre切除辅助病毒包装信号的有效性。方法:通过PCR及酶处理法依次将2个同向的loxP位点及绿色荧光蛋白表达盒克隆至pShuttle穿梭载体质粒,按照AdEasy系统的标准实验方法产生和扩增辅助病毒;同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,并用该载体经脂质体法转染HEK293细胞,通过PCR和流式细胞术分析转染细胞内表达的Cre重组酶对随后感染的辅助病毒的包装信号的切除作用。结果:构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内扩增,其包装信号可以由细胞内表达的Cre重组酶有效切除。结论:构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,为第三代腺病毒的生产奠定了实验基础。 相似文献
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乳头瘤病毒的外壳由L1蛋白和L2蛋白共同构成。L1是构成病毒外壳的主要成分,L2则可能与病毒DNA的携带有关。本文就近些年关于乳头瘤病毒外壳蛋白结构与功能、病毒外壳的构建,以及病毒外壳在构建时对DNA的包装等方面等方面的研究进展进行了综述。 相似文献
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A型流行性感冒病毒的负链RNA基因组由编码病毒中12个蛋白质的八个节段组成。在病毒组装的最后阶段,病毒体从细胞顶端胞浆膜突出时将这些基因组的病毒体(v)RNAs吸收进其中。基因组分段赋予了流感病毒进化的优势,但也提出了问题,在病毒体组装时需要八个节段每一个的至少一个复制本以产生完全有传染性的病毒颗粒。历史上一直存在争论:一方赞同确保足额的基因组合并的特异性包装机制;另一方赞同基因组节段被随机选择而不是以充足数量被包装以确保能自行产生合理比例病毒体的替代模式。近年来人们对该问题已达成一致意见:大多数病毒体仅包含八个节段,特异性机制为选择每个vRNA的某一复制本的确发挥了作用。本综述总结了得出这一结论所做的工作,叙述了在识别特异性包装信号方面最新的进展,讨论了这些RNA元素运转的可能机制。 相似文献
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腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷性DNA病毒,其基因组两端的两个倒转末端重复序列(ITR)是rAAV包装复制所必需的自身结构.ITR容易缺失并影响病毒颗粒的包装和感染力.比较两个ITR完整的和一端ITR缺失的AAV病毒发现,一端ITR缺失的AAV载体质粒包装病毒的效率明显比ITR完整的质粒低.用这两种AAV病毒感染293细胞、HeLa细胞和小细胞肺癌细胞NCI H446细胞,显示两个ITR完整的AAV病毒感染细胞的能力明显比一个ITR缺失的病毒强.说明ITR缺失对AAV病毒的包装和感染力都有明显的影响.因此,筛选两个ITR完整的AAV载体质粒,并稳定其基因组的结构,对提高病毒生产的产量和增强病毒的感染力都有显著的价值. 相似文献
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MS2噬菌体为正义单链RNA噬菌体,基因组含有3569个核苷酸,编码成熟酶蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白。MS2噬菌体复制酶编码基因5'端一个由19个碱基组成的茎环结构(又称包装位点)是衣壳蛋白二聚体与RNA相互作用的部位,二者相互作用形成的复合物是启动噬菌体自我包装的信号。MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合的特异性已被应用于RNA病毒核酸检测的标准物质、校准品和质控品的研究,实时动态监测活细胞内RNA的运动,以及RNA体内递送载体的研究等领域。 相似文献
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是新型冠状病毒肺炎感染(Coronavirus disease 2019, COVID-19)的致病病毒。面对此类高传播风险及高致病性病毒,常采用复制缺陷型假病毒替代活病毒用于疫苗及药物的抗病毒活性评估。本研究旨在建立了一种基于流式细胞技术(Flow cytometry, FCM)的高通量中和试验方法。使用HIV-1慢病毒骨架蛋白包装系统,将psPAX2、pLVXeGFP、SARS-CoV-2 S三质粒共转染HEK293T细胞,包装一种带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, eGFP)的假病毒。通过优化S蛋白密码子序列、采用S蛋白C-端氨基酸(Amino acids, AA)截短和包装时间的优化,确定了假病毒包装最适条件。包装假病毒的滴定采用293T-hACE2细胞作为感染靶细胞,经流式细胞仪测定eGFP荧光细胞比率即为感染假病毒细胞比率。采用包装的野生型(Wild type, WT... 相似文献
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[目的]分析影响HIV-1假病毒包装的主要因素,建立该假病毒包装的优化条件.[方法]用单因素分析对比的方法,比较了对病毒包装效果有重要影响的转染试剂、转染试剂与质粒的数量、培养基血清类型、细胞周期阶段对于病毒包装效果的影响.[结果]对45批150盘病毒包装结果分析显示,使用PEI转染试剂成本低,转染效果好,其N/P在8-40均可以产生高活性的包装病毒;用进口血清包装时,相对于国产血清结果重复性高;细胞周期处于S及G2/M期时转染质粒相对于S以及G0/G1期有较高的病毒活性.[结论]用PEI为转染试剂可以包装出高活性的病毒,包装获取高活性病毒可以通过质粒与PEI梯度比例以及血清类型构成多个组合策略来实现. 相似文献
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黄病毒科病毒核衣壳蛋白的核仁定位在病毒颗粒包装与病毒复制中发挥重要作用。为鉴定黄病毒科的猪瘟病毒Core蛋白核仁定位序列,本研究构建了将Core蛋白、截短突变体和氨基酸位点突变体分别与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP )融合的真核表达质粒,转染至PK15细胞后进行表达和定位分析,结果显示 Core蛋白核仁定位序列为PESRKKL,其关键氨基酸为R76K77,对理解猪瘟病毒Core蛋白结构与功能和为后续研究Core蛋白在病毒复制及颗粒包装中的作用有重要意义。 相似文献
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家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori parvo-like virus,BmPLV)是一种二分病毒,该病毒在家蚕中肠柱状细胞核内复制和包装,感染的细胞核呈现过分膨胀、细胞核孚尔根浓染等细胞病理学特征。病毒粒子直径20~24 nm,无囊膜呈球型。基因组为单链线性双分子DNA(VD1、VD2),分别独立包装在各自的衣壳中。病毒编码四个非结构蛋白NS1、NS2、NS3和pol(DNA聚合酶),一个主要结构蛋白VP及次要结构蛋白P133。其基因组末端反向重复序列可形成与BmPLV复制有关的"锅柄形"结构,以及含自身编码的DNA聚合酶的序列,推测该病毒与腺病毒复制方式相类似,依靠共价蛋白为起始物完成复制。 相似文献
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RNA复制子是一种能自主复制的RNA载体,保留了病毒非结构蛋白(复制/转录酶)基因,而结构蛋白基因缺失或由外源抗原基因替代,复制/转录酶可控制载体RNA在细胞质中高水平复制以及外源基因的高水平表达。在黄病毒属病毒感染性克隆基础上,其复制子载体得到了成功的构建。黄病毒属病毒复制子为病毒基因组结构功能研究、表达载体构建、假病毒包装及新型疫苗制备等提供了新的技术平台。本文综述黄病毒属病毒复制子的构建原理、方法及应用。 相似文献
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慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一,高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键.本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的第3代慢病毒载体系统,用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T包装细胞,培养48~72 h收集病毒上清液,通过超速离心进行浓缩,采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度.结果显示,用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T细胞,经检测病毒滴度达到5×108IU/mL以上,初步建成了高滴度慢病毒包装平台,为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础. 相似文献
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以自我失活型逆转录病毒载体pSIR为基础,构建了含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的载体pSIR-EGFP和含有870bp p16启动子载体pSIR-EGFP-870.将两种病毒载体转染至包装细胞包装成病毒颗粒.病毒感染2BS靶细胞,病毒5′LTR在逆转录过程中自我灭活.通过该系统观察到p16启动子在2BS细胞衰老过程中,转录活性明显增强.结果表明,自我失活型逆转录病毒载体能很好地用于衰老基因转录调控的研究. 相似文献
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目的:建立并优化重组水疱性口炎病毒(VSV)载体病毒包装体系,以获得稳定高效的重组VSV载体疫苗包装系统。方法:以prVSVΔG-GFP为骨架载体,pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L为辅助载体,探索不同的骨架质粒及辅助质粒用量、包装细胞系、重组痘病毒vTF7-3作用时间、转染试剂作用时间等因素对重组VSV载体病毒包装的影响,用光学显微镜及荧光显微镜观测重组VSV载体病毒的包装效果,应用TCID50法测定重组VSV的滴度。结果:重组VSV的包装效率随着辅助质粒或包装质粒总量的减少而降低,293T细胞较BHK21-WI2细胞包装效率更高,适当延长重组痘病毒vTF7-3作用时间或转染试剂作用时间能提高VSV包装效率。优化的病毒包装条件为:选用293T细胞,v TF7-3以5~15 MOI感染细胞1 h或以5 MOI感染细胞1~4 h,总质粒用量为3.67~22μg,转染细胞6~14 h可获得高效包装的rVSVΔG-GFP。采用优化包装条件高效包装了rVSVΔG-ZE病毒。结论:获得了稳定高效的重组VSV包装体系,为重组VSV载体的疫苗研究奠定了基础。 相似文献
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本文介绍了细胞因子信号传导及其产生的调节作用,着重介绍了干扰素以及几个炎性细胞因子的特性、信号传导途径及生物学功能,论述了病毒逃避宿主防御的机制以及细胞因子在免疫反应和病毒相互作用中的机能 相似文献