纤枝短月藓BeLEA2基因的克隆及表达分析

为探究纤枝短月藓LEA2基因的结构和表达特征,该研究以纤枝短月藓为材料,首次利用PCR克隆技术得到纤枝短月藓BeLEA2基因序列,并对该基因进行分析。结果表明:(1)该基因序列中含有2个外显子和1个内含子,其开放阅读框(ORF)为456 bp,编码151个氨基酸,预测其相对分子质量为16515.96 Da。(2)将纤枝短月藓与其他植物LEA2基因氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示纤枝短月藓与小立碗藓的亲缘关系最近。(3)利用HiTail-PCR技术克隆获得1072 bp的BeLEA2启动子序列,用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他顺式元件。(4)实时荧光定量PCR分析表明,BeLEA2基因在纤枝短月藓不同发育时期和不同组织中都有表达,且对脱水胁迫有响应。以上结果为进一步探究LEA2基因在苔藓植物中的功能及作用机制奠定了基础。     

Characterization and tissue-specific expression of phosphatidylcholine transfer protein gene from amphioxus Branchiostoma belcheri

An amphioxus cDNA, encoding phosphatidylcholine transfer protein (AmphiPCTP), was identified for the first time from the gut cDNA library of Branchiostoma belcheri. It contains a 660-bp open reading frame corresponding to a deduced protein of 219 amino acids. Phylogenetic tree analysis showed that AmphiPCTP clustered with PCTP subgroup of PCTP subfamily containing steroidogenic acute regulatory protein (StAR)-related lipid transfer (START) domains. AmphiPCTP had an exon-intron organization similar to that of human and rat PCTP genes in terms of both exon number and sequence homology of each exon, suggesting that PCTP has probably maintained a similar function in both amphioxus and mammalian species. Both in situ hybridization histochemistry and whole-mount in situ hybridization revealed a tissue-specific expression pattern of AmphiPCTP with the high levels in the hepatic caecum and primitive gut, including the region where the hepatic caecum will form later during development. This apparently agrees with the hypothesis that amphioxus hepatic caecum is equivalent to vertebrate liver. These results suggest a conserved role of PCTPs in amphioxus as well as mammalian species. This work was supported by National Science Foundation of China (NSFC; 30470203) and Ministry of Education of China (200404023014).     

旱麦草EtAP2基因的克隆及其对干旱胁迫的响应表达

以旱麦草(Eremopyrum triticeum)为实验材料,利用RT-PCR技术从旱麦草叶片中克隆了1个AP2/ERF家族基因,命名为EtAP2(GenBank登录号KX622583)。EtAP2基因含有1 128bp开放阅读框,编码375个氨基酸,相对分子质量40.87kD,等电点为5.36。多序列比对和进化树分析表明,该基因编码蛋白具有2个AP2保守结构域,与小麦AP2/ERF家族蛋白具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析表明,15%PEG 6000模拟干旱胁迫可诱导EtAP2基因在根和叶中表达,且在根中对干旱胁迫的响应大于叶片。研究表明,EtAP2可能参与旱麦草对干旱逆境胁迫应答的调节。     

Cat-2 gene expression

Summary Poly(A)⁴ RNA was isolated from maize scutella of different stages of post-germinative development and translated in vitro in a rabbit reticulocyte translation system. Immunoprecipitation of the translation products with CAT-2-specific antibody was used to quantitate the relative levels of translatable CAT-2 mRNA at each stage. The results show a close correlation between the developmental profile of Cat2 gene expression and the profile of CAT-2 mRNA levels. Evidence that the levels of CAT-2 mRNA are regulated by a temporal regulatory gene (Car1) is presented and the possible mechanism(s) of this regulation discussed.This work was supported by Research Grants No. GM22733 and No. GM33817 from the U.S. National Institutes of Health, Public Health Service to J.G.S. This is paper No. 9933 of the Journal Series of the North Carolina Agricultural Research Service, Raleigh, NC 27695, USA     

油葵HaFAD2-2基因的克隆及表达分析

脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturase,FAD2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内生成多不饱和脂肪酸的关键酶。根据已报道的向日葵(Helianthus annuus L.)FAD2基因序列,设计引物进行RT-PCR,克隆得到油葵FAD2-2基因全长cDNA,命名为HaFAD2-2。该基因开放阅读框为1 152bp,编码383个氨基酸,相对分子质量43.96kD,等电点为8.56。对基因组进行内含子调查发现,该基因在编码区内没有内含子。多序列比对和系统进化分析发现,FAD2-2基因编码蛋白与金盏菊(Calendula officinalis)、斑鸠菊(Vernonia galamensis)等菊科植物具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析表明,HaFAD2-2基因在根、茎、叶、花、子叶和未成熟种子中均有表达,且以叶中的表达量最高,未成熟种子中的表达量最低;低温(5℃、15℃)胁迫处理能显著促进该基因在根中的表达,抑制其在叶中的表达;盐胁迫(300 mmol/L NaCl)处理对其表达也具有抑制作用。该研究结果可为进一步探讨HaFAD2-2基因的功能奠定基础。     

夏枯草PvDXS基因的克隆和表达分析

该研究在夏枯草转录组测序的基础上设计特异引物,采用逆转录PCR技术获得该基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR法分析PvDXS在夏枯草不同组织及不同外源性物质诱导下的表达量。结果表明:克隆得到的PvDXS基因开放阅读框2 181 bp,编码726个氨基酸,理论分子量为78 040.47 D,等电点为6.75,PvDXS蛋白具有Transketolase_C结构域和Transket_pyr结构域,系统进化树结果表明,PvDXS蛋白与丹参、长春花的DXS(SmDXS2、CrDXS2)亲缘关系较近,推测PvDXS属于第Ⅱ类DXS蛋白。qRT-PCR分析表明,PvDXS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA₃处理组该基因表达量升高,其他6种外源性物质处理后表达量均降低,其中CaCl₂、SNP、SA处理后该基因的表达量显著降低。PvDXS基因在不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。这为进一步研究PvDXS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

毛白杨PtoGSTF4基因克隆及相关特性鉴定

该研究从毛白杨中克隆到1个Phi类谷胱苷肽S-转移酶（GST）基因（PtoGSTF4）,编码213个氨基酸。表达模式分析发现,PtoGSTF4在正常生长、H₂O₂和莠去津处理后的茎、叶以及茎的韧皮部均表达,属于组成型表达基因。在大肠杆菌中表达并纯化了PtoGSTF4重组蛋白,酶学性质分析表明PtoGSTF4对CDNB、NBD-Cl、NBC和Cum-OOH等4种底物均有活性。动力学分析发现,PtoGSTF4对GSH具有较高的亲和力,而对CDNB的亲和力相对较低。在不同pH及温度条件下对PtoGSTF4蛋白进行活性检测,发现PtoGSTF4在pH 7.5~10.5范围内或30 ℃~60 ℃温度范围内有较高的活性。研究推测,PtoGSTF4可能在毛白杨的抗逆生理中发挥重要作用。     

Presence of prophenoloxidase in the humoral fluid of amphioxus Branchiostoma belcheri tsingtauense

The presence of phenoloxidase (PO) activity in the humoral fluid of amphioxus Branchiostoma belcheri tsingtauense was electrophoretically and spectrophotometrically studied. The enzyme was present in the humoral fluid predominantly as an inactive proenzyme, prophenoloxidase (proPO). The optimum temperature for activation of the proPO ranged from 30 degrees C to 35 degrees C, and the enzyme exhibited optimum activity at pH between 7.0 and 7.5. ProPO in the humoral fluid was readily activated to active form PO by exogenous elicitors such as trypsin, zymosan and LPS. The activation of the proPO by exogenous elicitors was significantly enhanced in the presence of 10 mM Ca2+, but was susceptible to serine protease inhibitors like soybean trypsin inhibitor and p-nitrophenyl-p'-guanidinobenzoate. PAGE revealed a single band of PO activity in the humoral fluid with an apparent molecular mass of 150 kDa, which was resolved to three bands with molecular masses of 44, 46 and 72 kDa, respectively, after SDS-PAGE. This is the first report on the presence of the enzyme PO in amphioxus humoral fluid.     

Cloning and characterization of a novel human TEKTIN1 gene

Tektins comprise a family of filament-forming proteins that are known to be coassembled with tubulins to form ciliary and flagellar microtubules. A new member of the tektin gene family was cloned from the human fetal brain cDNA library. We hence named it the human TEKTIN1 gene. TEKTIN1 cDNA consists of 1375 bp and has a putative open reading frame encoding 418 amino acids. The predicted protein is 48.3 kDa in size, and its amino acid sequence is 82% identical to that of the mouse, rat, and dog. One conserved peptide RPNVELCRD was observed at position number 323–331 of the amino acid sequence, which is a prominent feature of tektins and is likely to represent a functionally important protein domain. TEKTIN1 gene was mapped to the human chromosome 17 by BLAST search, and at least eight exons were found. Northern blot analysis indicated that TEKTIN1 was predominantly expressed in testis. By in-situ hybridization analysis, TEKTIN1 mRNA was localized to spermatocytes and round spermatids in the seminiferous tubules of the mouse testis, indicating that it may play a role in spermatogenesis.     

独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。     

中华苜蓿根瘤菌噬菌体的分离及主要壳蛋白基因g23的系统进化分析

【目的】揭示苜蓿根瘤菌噬菌体的形态学特征及主要壳蛋白g23基因的分布地位,为根瘤菌噬菌体的生态学研究提供数据支持。【方法】以中华苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti USDA1002T)为宿主,采用双层平板法分离土壤环境中的苜蓿根瘤菌噬菌体,利用电子显微镜观察纯化的噬菌体形态特征;提取噬菌体DNA,PCR扩增编码噬菌体壳蛋白的g23基因,构建系统进化树,以形态学鉴定和分子生物学相结合的方法,明确分离获得的苜蓿根瘤菌噬菌体g23基因的系统进化地位。【结果】分离获得了3株噬菌体,头部均呈二十面体,直径大小为81–86 nm,尾部有收缩尾鞘,长度大约为54–70 nm。克隆测序结果显示,获得的3株噬菌体g23基因株间相似度较高,但与可培养的Exo T-、Schizo T-、T-、Pseudo T-evens相似度较低。系统进化分析表明,获得的3株噬菌体不隶属于目前已划分的不同环境噬菌体g23基因的分类类群中。【结论】3株噬菌体均属于肌尾噬菌体科的裂性噬菌体,与目前获得的所有噬菌体g23基因相似性较低,属于新的侵染中华苜蓿根瘤菌的噬菌体株。     

小麦胁迫相关基因TaSF3B2的克隆及表达特性分析

为研究小麦剪接因子在逆境胁迫中的作用,通过分析小麦抗性相关EST数据库,筛选并克隆获得1条2 327bp的核苷酸序列。该序列包含了一个1 854bp的开放阅读框,编码一个由617个氨基酸残基组成的蛋白,氨基酸同源比对发现,该蛋白含有GUS1结构域(Splicing Factor 3B,Subunit 2),属于剪接因子3b亚基中的一员,将该蛋白命名为TaSF3B2。生物信息学分析显示,TaSF3B2平均亲水系数(GRAVY)为-0.895,不稳定系数为43.92,且在细胞核中发挥作用的可能性最大。实时荧光定量PCR分析表明,TaSF3B2基因在不同组织中存在差异表达,不同发育时期其表达也存在差异;在幼苗叶片中,该基因表达受高盐、低温、条锈菌、干旱及ABA激素胁迫明显下调表达,而在幼苗根中变化不明显。推测TaSF3B2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时在小麦应对逆境胁迫的过程中具有重要的作用。     

刺梨GL2同源基因的克隆、系谱树和表达分析

为了观察刺梨果实的果刺细胞学发育过程,该研究以刺梨‘贵农5号''的cDNA为模板,通过RACE克隆获得刺梨中与拟南芥表皮毛形成GL2的同源基因RrGL2,并对该基因进行生物信息学分析和表达分析。结果表明:(1)刺结构在花芽形成早期基部内的细胞首先不断分裂,向外继续发育,中部的细胞变细、变长形成“针”状结构,顶部的细胞逐渐木质化使刺变硬,形成果刺。(2)通过RACE扩增得到RrGL2的cDNA全长2 292 bp,编码763 aa氨基酸。(3)RrGL2具有Homeodomain同源结构域和StAR磷脂酰胆碱转移蛋白的结构域,RrGL2与其他物种编码的GL2氨基酸同源性高度相似,并且系谱树分析揭示刺梨RrGL2和野草莓的GL2密切相关。(4)qRT-PCR分析表明,RrGL2在茎和果实中的表达水平高于其他组织,在花后7周果刺中的表达最高,是3周和5周果刺中的7.87倍和2.10倍。综上结果发现RrGL2的功能与果刺的形成发育密切相关,该研究为刺梨中刺形成的分子机制和育种提供了理论基础。     

Cloning and sequencing of the HU-2 gene of Escherichia coli

Summary The Escherichia coli HU-2 gene was cloned using a DNA fragment from the HU-1 gene as a probe. The amino acid sequence of the HU-2 protein deduced from the nucleotide sequence is in good agreement with the published sequence. The nucleotide sequence has a possible promoter and a typical ribosomal binding site upstream of the translation initiation codon (AUG) and a possible rhoindependent terminater site downstream of the termination codon (UAA) of the gene.     

地黄核苷二磷酸激酶基因的克隆及生物信息学分析

核苷二磷酸激酶(NDPK)是一种高度保守的多功能蛋白,具有催化底物磷酸化的作用,能够参与植物的生长发育、非生物胁迫、感病应激、光合作用和能量代谢等过程。为了解地黄核苷二磷酸激酶基因(RgNDPKⅠ)的结构、功能和性质,该研究利用地黄转录组学数据,通过电子克隆的方法获得了RgNDPKⅠ基因的全长cDNA序列,长度为765 bp。生物信息学分析结果表明,RgNDPKⅠ基因的开放阅读框长度为447 bp,编码148个氨基酸,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点。RgNDPKⅠ基因编码的蛋白质定位于细胞质,是无跨膜区域的亲水性蛋白,该蛋白质与芝麻、紫花风铃的核苷二磷酸激酶相似性较高,分别为97%和96%。在多种生物中已经克隆得到了核苷二磷酸激酶基因,且不同植物核苷二磷酸激酶氨基酸序列中存在多个相似的保守结构域,推测RgNDPKⅠ基因所编码的蛋白质为核苷二磷酸激酶超家族成员。该研究结果为进一步探明RgNDPKⅠ的性质、结构、功能及表达机制提供了重要的理论依据。     

赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析

为了解赤桉(Eucalyptus camaldulensis)肌动蛋白(Actin)在生长发育过程中的功能,根据赤桉幼苗转录组数据库中的肌动蛋白基因序列,从赤桉嫩叶中克隆了2条Actin基因片段,并利用RACE技术获得Actin基因的全长cDNA,分别命名为ECACT1和EC-ACT2基因。生物信息学分析表明,这两条基因的全长cDNA分别为1533 bp和1387 bp,均含有1个编码377个氨基酸的开放阅读框。经比对分析,赤桉Actin蛋白的氨基酸序列与其他植物Actin蛋白的具有较高的相似性,并且具有Actin蛋白特有的保守序列和相关特征。因此推测这两条基因对桉树的生长发育具有一定的调控作用。     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut+表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

文心兰乙烯不敏感基因EIN2的克隆及表达分析

该研究采用PCR、RACE方法,对文心兰‘南茜’的乙烯不敏感蛋白基因（ethylene insensitive 2,EIN2）进行克隆及生物信息学分析,并采用qRT PCR技术,对该基因在文心兰不同组织器官和不同花期中的表达模式进行分析。结果表明：（1）成功克隆得到文心兰_EIN2基因序列,命名为OnEIN2（MH497388）;该基因cDNA序列全长为4 177 bp,其中开放阅读框3 879 bp,编码1 292个氨基酸,3′非编码区长208 bp,5′非编码区长90 bp。（2）生物信息学分析显示OnEIN2是一个不稳定的疏水蛋白,含有跨膜结构,分子式为C₆₄₀₆H₉₉₈₈N₁₆₇₀O₁₈₉₇S₄₇;蛋白质分子量142.22 kD,理论等电点5.80。多序列比对和系统进化分析表明,文心兰EIN2与铁皮石斛EIN2的相似度最高（81.98%）,二者亲缘关系也最为接近。（3）实时荧光定量PCR分析发现,OnEIN2基因在根、茎、叶花中均有表达,在花中表达量最高,茎中表达量最低;而在不同花期中,盛开期表达量最高,其次是衰老期。研究表明,文心兰OnEIN2基因在开花和衰老过程中可能有重要的作用。     

向日葵MADS-Box基因HAM23-like克隆和表达分析

为了解MADS-box基因在向日葵(Helianthus annuus)花发育过程中的作用,采用RT-PCR技术克隆了1个MADS-box基因新成员HAM23-like,开放阅读框为831bp,编码276个氨基酸,相对分子量为30.52k D,理论等电点为9.42。系统发育分析表明,HAM23-like与拟南芥的AGL18聚于同一分支,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析表明,HAM23-like基因在花和成熟果实(籽粒饱满期)中的表达量较高;HAM23-like在开花当天的雄蕊中的表达量最高;随着花的发育,HAM 23-like表达量逐渐升高,在开花后5 d (果实形成早期)达到最高表达水平。因此,推断HAM23-like基因可能与向日葵花器官后期发育和瘦果早期发育相关。     

甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析

该研究以甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)为实验材料,通过RT-PCR方法从甘菊转录组数据中分离出热激蛋白合成相关基因,命名为ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明,ClHSP70基因ORF全长为2 559bp,编码852个氨基酸,蛋白功能区预测表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守结构域;ClHSP90基因ORF全长为2 094bp,编码697个氨基酸,含有HATPase结构域和HSP90保守结构域。生物信息学分析表明,甘菊ClHSP70与大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tomentosiformis)HSP70蛋白有较高的一致性,ClHSP90基因编码的氨基酸序列与紫茎泽兰(Ageratina adenophora)HSP90高度相似;实时荧光定量表达分析表明,在42℃处理不同时间,甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达均在0.5h时显著增加,1h达到最大值,2h后缓慢下降;不同组织表达分析表明,甘菊在42℃处理1h后,ClHSP70在成熟叶中的表达量显著高于嫩叶和根等其他组织;ClHSP90在成熟茎中的表达量最高。研究说明,ClHSP70和ClHSP90基因具有热激蛋白特征,参与了甘菊热胁迫应答过程,该研究结果为以后深入研究其基因功能奠定了基础。