碱性成纤维细胞生长因子对培养的瘢痕成纤维细胞FN合成的调控作用

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对成纤维细胞纤维连结蛋白（FN）合成的调控作用。方法采用细胞培养、ELISA法、RT-PCR方法观察bFGF在不同剂量下对瘢痕来源的成纤维细胞FN合成的影响。结果FN的表达在低bFGF浓度组与对照组无明显差异,随着浓度的升高表现为增高趋势,以50、100、500ng／ml最显著,与对照组之间有显著性差异（P〈0．05）。FN mRNA表达在50-100ng／ml组明显升高,与对照组间有显著性差异（P〈0．05）。mRNA表达趋势与上清中蛋白的表达具有一致性。结论高浓度bFGF刺激FN合成可能是bFGF促进创面愈合的重要原因。     

家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因．构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUC m-T／Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a（＋）和pGEX-4T-1。构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a（a＋）／Attacin和pGEX-4T—1／Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制。从pET30a（＋）／Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T—1／Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。     

重组人bFGF的原核表达及功能分析

为研究重组人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor, bFGF)的原核表达及纯化条件,并分析其功能,该研究根据bFGF基因序列,优化密码子,构建pE T-28a原核表达载体,经IPTG诱导, SDS-PAGE电泳分析验证,采用Ni柱进行分离纯化目的蛋白bFGF。培养NIH3T3细胞、HEK293细胞及CHO细胞,并进行CCK-8实验检测蛋白活性。结果显示,成功构建原核表达载体。经电泳分析,在1 mmol/L IPTG诱导条件下,成功表达目的蛋白bFGF,表达量约占菌体蛋白量32%,蛋白纯度约为96%。活性检测结果显示, ED_(50)分别为5.97 ng/mL、4.21 ng/mL、6.71 ng/mL,可以有效促进NIH3T3细胞、HEK293细胞及CHO细胞增殖。该研究得出,经原核表达系统成功表达人bFGF蛋白且其活性较高。     

RGD重组人IL-10的克隆、表达及其拮抗纤维化的初步研究

白细胞介素10(IL-10)是一种多效细胞因子,在炎症、免疫反应以及在疾病的发生过程中发挥着重要作用,RGD是能够特异与新生血管内皮细胞整合素结合的多肽序列。将RGD连接到IL-10的羧基端,期望构建新生血管内皮细胞特异导向结合型融合蛋白。以人外周血淋巴细胞cDNA为模板,扩增的PCR产物经克隆载体pMD18-T,连至原核表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了pET-IL10-RGD表达载体的重组菌(pET-IL10-RGD/BL21)。SDS-PAGE分析表明:在19.3 kDa处有明显的新生蛋白带,符合理论预期。Western blot分析表明:诱导表达、分离纯化的目的蛋白能够与IL-10抗体特异结合,且纯化产物IL10-RGD具有与IL-10相同的生物学活性。利用培养的人皮肤成纤维细胞,观察了IL10-RGD对TGF-β1刺激成纤维细胞的I型胶原(Col1)、III型胶原(Col3)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结体组织生长因子(CTGF)蛋白水平及α-SMA免疫细胞化学的变化。结果表明:纯化产物IL10-RGD能够明显抑制TGF-β1刺激的成纤维细胞Col1、Col3、CTGF和α-SMA蛋白水平的升高;抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。可见,成功克隆、表达并纯化了IL10-RGD融合蛋白,该融合蛋白能够明显拮抗TGF-β1诱导的纤维化,预示着该蛋白在瘢痕增生及皮肤纤维化治疗方面有着较好的应用前景。     

内毒素结合肽的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

重组人内毒素结合肽 (endotoxinbindingpeptide ,EBP)融合蛋白在大肠杆菌中表达 ,分离和纯化后对其进行生物学活性观察 .将构建好的PinpointⅩa3 EBP生物素融合表达载体转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达菌株 ,亲和层析法纯化表达产物 ,因子Ⅹa(factorⅩa)切割分离内毒素结合肽 ,采用凝胶过滤和反相液相高效色谱法两步纯化 ,从相对分子质量、N端 1 0个氨基酸的序列分析等方面进行鉴定 ;利用人单核细胞U937对重组内毒素结合肽进行了生物学活性的检测 .结果发现 ,内毒素结合肽以包涵体形式存在 ,因子Ⅹa酶切融合蛋白后得到 3 5kD的内毒素结合肽 ,纯化后内毒素结合肽纯度达 99%以上 ,N端 1 0个氨基酸的分析结果与预期相符 ;初步证实内毒素结合肽具有较好的LPS结合活性 ,能够抑制LPS的作用 .经原核表达及纯化复性 ,获得了具有较好生物学活性的内毒素结合肽 ,为进一步研究其功能奠定了良好的基础     

抗菌肽CM4与人可溶性B淋巴细胞因子hsBAFF在大肠杆菌中的融合表达

为进一步探讨抗菌肽CM4的原核表达及其生物学功能,本实验研究了抗菌肽CM4与人可溶性B淋巴细胞刺激因子hsBAFF的融合表达及抗菌肽CM4的生物学活性。运用PCR把B淋巴细胞因子hsBAFF和家蚕抗菌肽CM4进行基因融合,构建了融合表达载体pET28a (+)/CM4-hsBAFF,并在大肠杆菌中获得高可溶性表达的融合靶蛋白,且存在于超声破碎后的上清,经分子筛Sephadex G-75纯化后的重组融合蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.SDS-PAGE分析表明：可以通过分子筛一步纯化得到融合蛋白,该重组融合蛋白的分子量约22.0 KDa。Western blot结果显示该重组蛋白能与鼠抗人hsBAFF的抗体发生特异性反应.运用基因工程的方法获得CM4-hsBAFF重组融合蛋白,并具有很好的抑菌生物学活性。     

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2／hTNFR：Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示：所构建的重组病毒rAAV2／hTNFR：Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR：Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。     

重组蛋白ES-Kringle5的表达、纯化及活性检测

目的：利用基因工程方法原核表达重组融合蛋白ES-Kringle5并进行纯化及活性检测。方法：ES-Kringle5是将内皮抑素N端的前27个氨基酸与Kringle5通过连接肽相连的重组融合蛋白,合成该重组蛋白的基因片段并插入载体pMD18-T中,然后克隆至大肠杆菌表达载体pET25b中并转化E.coli BL21（DE3）。乳糖诱导表达后经Ni-NTA亲和层析纯化后获得目的蛋白。通过抑制HUVEC细胞增殖实验检测其生物学活性。结果：重组质粒构建正确。利用乳糖诱导表达并降低诱导温度能增加目的蛋白的产量及可溶性表达。纯化后的重组蛋白纯度大于95%。生物学活性证明该重组蛋白具有抑制HUVEC的增殖能力。结论：具有生物学活性的重组蛋白ES-Kringle5可在大肠杆菌中高效表达,为研究其体内药效、药代及安全性评价奠定了基础。     

胸腺素a1／干扰素a-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛m1基因,与含,IFNa-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建％1／IFNar-2b融合基因重组质粒pUCl8-Ta1／IFN,经序列分析证实,融合基因m1和,INFa-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100％和98．5％,仅IFNa-2b有两处碱基发生无义突变．再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Ta1／IFN,转化到EcoliM15经IPTG诱导,实现了Ta1-1FNa-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24．5％,为包涵体形式．这为研制Ta1—IFNa-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础．     

化学合成虎纹捕鸟蛛毒素-I基因的克隆和表达

本文报道了全化学合成虎纹捕鸟蛛毒素－Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达,表达产物为Ｎ－端是谷胱甘肽硫转移酶的融合蛋白．经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化,凝血酶酶解融合蛋白,得到重组ＨＷＴＸ－Ⅰ（ｒＨＷＴＸ－Ⅰ）．质谱和氨基酸顺序分析均表明ｒＨＷＴＸ－Ⅰ系正确表达产物．还原复性的ｒＨＷＴＸ－Ⅰ表现出与天然ＨＷＴＸ－Ⅰ生物学活性的一致性．     

bFGF不能调节人结膜下Tenon's囊成纤维细胞表型改变

探讨了碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）能否对人结膜下Tenon’S囊成纤维细胞（human subconjunctival Tenon＇s capsule fibroblast,HTCF）表型改变起诱导作用。在5例白内障手术中取人结膜下Tenon＇s囊组织块培养成纤维细胞。用不同浓度bFGF（0、5、10、20ng／ml）诱导HTCF 48 h。免疫细胞化学技术、蛋白质印记免疫技术检测其平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）表达与正常HTCF有否差异。实验结果表明用不同浓度（0-20ng／ml）bFGF诱导HTCF48h,虽能明显促进HTCF细胞的生长,但均不能上调细胞内α-SMA的表达。在0-20ng／ml范围内,体外用bFGF诱导HTCF48h,不能诱导其改变为肌成纤维细胞。     

新城疫病毒ZJ1株F蛋白裂解位点突变对其融合活性的影响*

新城疫病毒ZJ1毒株是近年来在我国水禽中流行并能引起水禽严重发病和死亡的强毒株,其F蛋白裂解位点有多个碱性氨基酸分布。将该毒株F蛋白裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸,构建了重组表达质粒pCI-FT。分别将突变前后的F蛋白与该毒株的HN蛋白在COS-1细胞共表达,表明突变前后的F蛋白均有融合活性;分别将突变前后的F蛋白与该毒株的HN蛋白在CEF细胞共表达,表明突变后F蛋白被裂解的活性大大降低。以上研究为下一步在全长cDNA克隆水平上对F蛋白裂解位点氨基酸序列进行相应     

牛c-myc基因的克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

为了构建包含牛c-myc基因编码序列的重组载体,以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛c-myc 基因的编码序列,将其亚克隆至pMD19-T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pIRES2-AcGFP1-Nuc表达载体上,挑选序列正确的重组真核表达质粒转染牛皮肤成纤维细胞,用RT-PCR和Western blotting分别检测c-myc mRNA和蛋白的表达。结果表明,从胎牛原始生殖嵴中正确克隆了c-myc基因的全长编码序列,所构建的重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中有效     

成纤维细胞生长因子20研究进展

成纤维细胞生长因子20(FGF20)是成纤维细胞生长因子家族(FGFs)的成员之一。研究发现,FGF20具有广泛生物学活性,不仅在退行性神经系统疾病,如帕金森病中起着重要作用,还在组织修复,肿瘤发生、器官发育等方面具有重要的生物学功能。尽管作为重组蛋白药物的开发其功能和机制仍有待进一步研究,但FGF20所具备的生物学特性将会有非常广阔的研究领域和应用价值。     

重组人gdnf乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究

为了制备重组人GDNF牛乳腺生物反应器,采用组织块贴壁法分离培养雌性牛胎儿成纤维细胞,连续继代培养75d,进行形态观察和染色体分析,在此基础上,转染带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双重筛选标记的重组人gdnf乳腺特异表达载体pNR-GDNF,G418筛选阳性抗性克隆,进行PCR法鉴定。结果表明,分离培养的牛胎儿成纤维细胞具有正常的形态、分裂增殖特性和染色体数目;目的基因已整合到转基因细胞的染色体上。     

aFGF荧光分子探针基因的合成及其表达

通过PCR技术和体外DNA重组技术将绿色荧光蛋白cDNA和酸性成纤维细胞生长因子cDNA构建成融合基因,克隆到表达载体pET3c中,构建成表达菌株BL21(DE3)/pET3c-GAF。经IPTG诱导表达,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25%;DNA测序结果表明设计合成的融合基因与预期相符。Westernblot结果表明重组蛋白具有aFGF的免疫原性。经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到强烈的绿色荧光。融合基因在大肠杆菌中实现了表达,用MTT法测得纯化融合蛋白与野生型aFGF促Blab/c3T3细胞增殖活性相当,为利用绿色荧光分子探针研究aFGF的在活体内的作用机制建立了新的方法。     

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

高效可溶性重组蛋白表达载体的构建

本研究构建了两种高效表达可溶性重组蛋白的原核表达载体。一种载体由HisSUMO序列与pET30a(+)载体连接而成(命名为HisSUMO Express),表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,用SUMO蛋白酶I切割后可获得不留任何残基的重组蛋白。SUMO-蛋白酶I价格较贵,为减少表达蛋白的成本,第二种载体即在His-SUMO和目的序列之间加入羟胺切割位点(命名为HisSUMO Economic)。在HisSUMO Economic中表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,羟胺液切割后可获得仅留一个甘氨酸残基的重组蛋白。以在常规表达载体中难以表达的鼠源成纤维细胞生长因子-21(mFGF-21)为例,经葡萄糖消耗实验检测其活性,验证两种表达载体的效果。结果表明mFGF-21在两种载体中均获得了高效表达,融合蛋白占菌体总蛋白的40%以上,Ni-NTA纯化后的融合蛋白分别利用羟胺切割液和SUMO蛋白酶I切割,纯化的mFGF-21成熟蛋白回收量约为54mg/L,回收率约为6%。经两种载体表达后的mFGF-21蛋白均具有生物学活性,可促进脂肪细胞消耗葡萄糖,为进一步研究提供了基础。     

高糖和bFGF对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：骨组织的形成是一个复杂的过程,受多种因素的影响,糖尿病所导致的持续高血糖对于成骨分化的影响机制尚不明确,以及在此分化过程中的各种细胞因子的作用机理仍不明了,现拟通过体外成骨诱导环境,观察高糖和碱性成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactorbFGF）对人骨髓间充质干细胞（humanmesenchymalstemcellshMSCs）成骨分化的影响。方法：hMSC在5．5mmol／L和25mmol／L葡萄糖浓度下培养6天,使用cck一8法测定各组细胞增殖情况;hMSC在两种糖浓度下成骨诱导28天,通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测、茜素红染色、钙结节半定量检测,对比各组成骨分化活性;在两种糖浓度成骨诱导液中加入10ng／mlbFGF,使用RT—PCR技术检测各组细胞OCN、OPNmRNA表达差异。结果：高糖较正常糖浓度细胞增殖率下降,ALP活性降低,茜素红染色钙结节量减少,RT—PCR检测结果显示25mmol／L组OCN、OPNmRNA表达量低于5．5mmol／L组,加入bFGF后,25mmol／L组仍低于5．5mmol／L组,与未添加bFGF同葡萄糖组比较表达增加。结论：高糖使hMSC增殖能力下降,在成骨分化的过程中ALP活性降低,成骨相关基因OCN、OPN表达量下降,证明了高糖对hMSC成骨分化具有抑制作用,当加入bFGF后,改善了高糖对hMSC的抑制作用,提示糖尿病条件下高糖的存在是导致hMSC成骨分化能力下降的不利因素,同时初步证明了bFGF参与了成骨分化的过程,从而为在分子水平探讨糖尿病患者种植义齿骨结合形成相关机制奠定初步的基础．．     

新城疫病毒ZJ1株F蛋白裂解位点突变对其融合活性的影响

新城疫病毒ZJ1毒株是近年来在我国水禽中流行并能引起水禽严重发病和死亡的强毒株,其F蛋白裂解位点有多个碱性氨基酸分布。将该毒株F蛋白裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸,构建了重组表达质粒pCI-FT。分别将突变前后的F蛋白与该毒株的HN蛋白在COS-1细胞共表达,表明突变前后的F蛋白均有融合活性;分别将突变前后的F蛋白与该毒株的HN蛋白在CEF细胞共表达,表明突变后F蛋白被裂解的活性大大降低。以上研究为下一步在全长cDNA克隆水平上对F蛋白裂解位点氨基酸序列进行相应突变,研究毒力相关因素以及构建毒力致弱疫苗株等奠定基础。