PGC-1α的转录调节和翻译后修饰

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)辅助激活因子-1α(PPARγcoactivator-1α,PGC-1α)是线粒体生物合成的关键调节分子.外界刺激(寒冷、饥饿、运动)一方面可以改变PGC-1α的基因和蛋白质表达水平,另一方面可以通过翻译后修饰方式调节其蛋白质活性,最终调节细胞能量代谢和线粒体生物合成过程.PGC-1α表达的异常是代谢性疾病及老年性疾病等发病的重要原因.本文就PGC-1α在转录水平和翻译后修饰水平的调节方式的最新研究进展作一综述.     

PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

目的: 确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法: 将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1^WT, pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156~509), pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156~581), pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果: Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论: PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。     

转录辅助活化因子PGC-1家族的生物学特性及功能

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1(PGC-1)家族共有PGC-1α,PGC-1β和PRC(PGC-1相关因子)3个成员,该家族在机体诸多代谢过程中发挥重要作用,包括调节机体适应性产热、线粒体的生成、脂质代谢、调节血糖平衡及葡萄糖转运、激活糖异生的关键酶和影响肌纤维类型的转换等.成员间功能也存在差异,PGC-1α的上述功能表现的较为明显,而PGC-1β在调节脂肪细胞分化及脂类代谢中具有独特的功能,PRC则仅发现其在调节线粒体的生物合成及细胞增殖中有作用.研究认为,通过调节PGC-1家族的生理功能,可治疗肥胖及糖尿病等疾病,尤其PGC-1β可作为改善机体胰岛素抵抗的新药物靶点.本文就PGC-1家族的特征、生理功能及相互作用研究进行简要综述.     

用无选择标记的转基因烟草表达胸腺素α1（Tα1）

胸腺素α1（thymosin α1,Tα1）作为免疫调节剂在T细胞成熟、分化和功能发挥方面扮演着重要角色,临床主要被用于免疫缺陷、病毒感染和自身免疫性疾病（HBV、HCV、HIV和癌症等）的治疗。由于组织提取Tα1原料限制、化学合成价格昂贵和传统表达系统（原核或转基因动物）存在安全隐患,使Tα1临床应用受限。用烟草表达Tα1,首先按植物偏爱密码子设计合成tα1基因（124bp）并重组串联成4×tα1,构建植物双元表达载体p35s∷4×tα1（含twin T-DNAs）,用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转化烟草。PCR和Southern blot结果证实获得了14转基因烟草,并发现靶基因4×tα1与筛选基因npt II在转基因烟草T0代基因组中发生了分别整合。对177株T1代转基因烟草检测,获得了2株仅整合4×tα1而无筛选标记npt II的植株。ELISA结果显示,4×Tα1在转基因烟草叶片中的表达量介于180.46（81#）~756.87 ng/g·fw（86#）,Western blot证实植物源4×Tα1具有免疫活性。MTT实验结果显示,植物源的4×Tα1蛋白具有促进BALB/c鼠脾淋巴细胞增殖的功能,为用安全植物表达系统生产包括Tα1在内的药用蛋白提供重要参考。     

帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白相互作用研究

目的 利用蛋白质组学方法和激光扫描共聚焦显微镜来鉴定帕金森病相关蛋白PINK1和α-突触核蛋白（α-synuclein）之间的相互作用关系及两种蛋白在MN9D细胞中的分布。方法 将α-synuclein基因插入pGEX-4T-1载体,经DNA测序证明形成GST融合蛋白,经大肠杆菌BL-2l表达纯化后,与MN9D细胞裂解液共孵育,检测PINK1与α-synuclein蛋白间的相互作用。并应用MN9D细胞的内源性PINK1与α-synuclein进行免疫共沉淀实验,进一步验证两蛋白之间的相互作用。MN9D细胞经免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的细胞内分布及共定位状态。结果 利用GST-α-synuclein融合蛋白捕获及免疫共沉淀技术,检测到特异的PINK1条带。激光扫描共聚焦显微镜检测到两者存在部分共定位。结论 PINK1和α-synuclein在体外和细胞内均可发生相互作用并在MN9D细胞中存在共定位关系。     

HPLC法测定重组人干扰素α1b粉雾剂的含量

采用高效液相色谱法测定重组人干扰素α1b粉雾剂的含量及均匀度。结果表明溶液中重组人干扰素α1b浓度在92.50~462.50μg/ml时峰面积（Y）与相应浓度（X）呈线性关系,（r=0.999 9）。并且在成品的含量测定时,重组人干扰素α1b的色谱峰峰形良好,杂质与流动相无干扰。本方法精密度、准确度高,稳定性良好,能够准确、迅速的测定重组人干扰素α1b粉雾剂成品中的主药含量及均匀度。     

C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1融合基因表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1)。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1融合蛋白能够被α、β1毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5944毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

α-螺旋型抗菌肽结构参数与功能活性的关系

随着耐药病原菌出现,寻求更为安全有效的新型抗菌制剂迫在眉睫。抗菌肽具有广谱抗菌活性,杀菌快,不易产生耐药性等优点,是理想的新型抗菌剂,具有广阔前景。α-螺旋型抗菌肽是抗菌肽中的一大类。本文从α-螺旋型抗菌肽螺旋度,疏水力矩,疏水性,净正电荷数等方面阐述了结构与功能关系,及构效关系在α-螺旋抗菌肽分子设计与改造中的应用。     

PGC-1β和SREBP-1c在猪脂肪细胞分化过程中的相互作用

为研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1β(PGC-1β)与SREBP-1c在猪前体脂肪细胞分化过程中的表达规律及其相互作用,分析二者功能上的联系,采用Western 印迹及细胞免疫荧光技术检测PGC-1β与SREBP-1c在猪脂肪细胞分化过程中的表达,shRNA干扰和免疫共沉淀技术分别探讨了PGC-1β对SREBP-1c的调节作用及2种蛋白质在体内的结合活性.结果显示,PGC-1β与SREBP-1c 蛋白的表达均随猪脂肪细胞分化逐渐增加,且在分化细胞的核和胞浆中均有分布. 干扰PGC-1β显著下调了SREBP-1c和脂肪细胞分化标记基因C/EBPα的表达(P<0.05),同时降低了细胞内甘油三酯的积累.免疫共沉淀证明,PGC-1β与SREBP-1c蛋白在猪脂肪细胞分化过程中存在结合作用. 以上结果表明,PGC-1β能够促进猪脂肪细胞分化并对SREBP-1c有调节和结合作用,推测二者的结合可能与其对脂肪细胞的分化调节机制相关,将对PGC-1β调控脂肪细胞分化的功能和机理研究提供新途径.     

多种翻译后修饰对低氧诱导因子-1α稳定性调控的机制

低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）是组织细胞对缺氧感应和调控的一类关键转录因子,在机体中广泛表达.作为细胞低氧应答反应中的重要调节因子,HIF-1能够调节100多种涉及低氧应激下细胞适应和存活的靶基因. HIF-1是由氧依赖的α亚基和细胞内稳定表达的β亚基构成的异源二聚体.其中α亚基对氧浓度变化敏感,是HIF-1的功能性亚基,它的表达活性决定了HIF-1的生物学活性.近期研究发现,HIF-1α的一系列翻译后修饰可改变其稳定性,进而调控其转录激活活性,从而参与肿瘤、低氧性肺动脉高压以及心血管疾病等的发生与发展.本文主要就HIF-1α的一列系翻译后修饰,如羟基化、泛素化、磷酸化、乙酰化、SUMO化修饰作一综述.     

α-溶血素的表达及其纳米孔的制备

α-溶血素(α-hemolysin,αHL)是金黄色葡萄球菌分泌的一种水溶性穿孔毒素,在双脂膜上可组装成结构稳定的七聚体蛋白纳米孔,是理想的单分子检测器件。以大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S作为表达宿主菌株诱导表达野生型和单位点突变型α-溶血素,超滤膜分子截留法纯化蛋白质,使用兔血红细胞膜将αHL单体组装成七聚体蛋白纳米孔,并在人工脂双层膜上构建适于单分子分析的分子器件。通过溶血实验和单通道电流记录,证实αHL溶血活性良好,组装的αHL七聚体纳米孔在双脂膜上打孔能力和离子通透性良好,结构稳定,可作为理想的单分子检测器件。此方法为大量制备αHL单体及其在单分子分析和应用研究方面奠定了基础。     

Thy1-αSYN基因小鼠出现代谢紊乱和胰岛形态及功能的改变

帕金森病(PD) 是第二大神经退行性疾病。PD的发病机制仍然不明确,普遍认为 α-突触核蛋白(α-synuclein) 的聚集和传播引起的神经损伤、线粒体功能障碍、炎症和氧化应激,自噬功能障碍等在PD 的发生发展中发挥作用。越来越多的研究认为,代谢紊乱也是PD的发病机制之一。我们检测了过表达α-突触核蛋白是否能引起小鼠代谢紊乱以及可能的机制。研究分为Thy1-αSYN转基因小鼠组(TG)及同窝对照野生小鼠组（WT）,分别检测它们在转棒仪上的停留时间,体重情况,血浆中胰岛素含量,小鼠糖耐量及胰岛素耐量等外周代谢情况。使用苏木精-伊红染色法对两组小鼠胰岛的形态进行观察,分离小鼠胰岛并使用葡萄糖刺激胰岛素分泌检测胰岛素分泌功能。结果显示, 12月龄的TG组小鼠与WT组相比运动耐力下降23.1%（P < 0.05）,体重增加7%（P < 0.01）,糖耐量降低（P < 0.05）,胰岛素耐量降低（P < 0.05）,外周血中胰岛素含量降低20%（P < 0.05）。TG组小鼠胰腺内α-突触核蛋白水平较WT组增加1.32倍（P < 0.05）,TG组小鼠的胰岛面积变小（P < 0.05）,胰岛个数减少（P < 0.01）,胰岛素分泌功能下降（P < 0.01）。我们的研究提示,α-突触核蛋白在PD中的作用不局限于对多巴胺能神经元的损伤,它能影响代谢及外周器官的形态及功能,这为PD的发病机制提供新的理论依据。     

流感病毒感染巨噬细胞对缺氧诱导因子-1α诱导炎症反应通路的机制研究

为探索缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α诱导甲型流感病毒毒株感染小鼠巨噬细胞引起炎症反应的具体机制,本研究以甲型H1N1流感病毒(简称H1N1)株A/PR/8感染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,在显微镜下观察其在感染后的表型变化,分别在不同时间段收集样本,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测HIF-1α、干扰素(interferon,IFN)-γ、白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和M蛋白(M protein,MBP)mRNA的变化,通过蛋白质印迹法(Western blot, WB)检测HIF-1α、核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)以及M蛋白的变化。随后,加入抑制剂2-MeOE-2(10 nmol/L)进行抑制试验,采用PCR和WB检测HIF-1α表达被抑制后上述炎症因子mRNA表达水平及炎症蛋白通路的变化。结果显示,H1N1PR8感染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,H1N1PR8复制率在24 h达到峰值,HIF-1α mRNA在感染6 h后开始升高,12 h迅速上升,24 h达到峰值。IFN-γ、IL-6、TNF-α mRNA变化趋势基本与HIF-1α一致,但在感染12 h并未进入快速上升期。HIF-1α蛋白在感染后6 h表达明显增多,24 h达到峰值,与mRNA变化水平基本一致。NF-κB通路蛋白在感染12 h后明显增多,48 h开始减少。加入抑制剂2-MeOE-2后,培养感染细胞24 h,抑制剂组IL-6、TNF-α mRNA水平较对照组显著下降(P<0.05),抑制剂组NF-κB通路蛋白较对照组表达下降。本研究结果表明,小鼠巨噬细胞被H1N1感染后,HIF-1α可能通过激活NF-κB通路促进IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌参与炎症反应。     

人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp,编码蛋白质分子质量为83 kD,等电点5.58,其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主,整体表现出亲水性,其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明,该酶被分类至亚家族Ⅱ,其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸,催化残基高度保守。为明确其酶学性质,以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR）为底物,通过紫外 可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量,得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5,且在30～46℃下保温30 min,不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力,首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明,该酶能普遍耐受1%的有机溶剂,甚至1%～ 5%的异丙醇和1%的β 巯基乙醇,有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时,仍能保持79%的酶活性。HFM Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1,HFM-Rha78的KM较大,为26.0 mmol L-1。转换数kcat为185.1 s-1,催化效率kcat/KM为7.1×103 s-1 mol-1 L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明,37℃条件下,随着酶浓度和水解时间增加,芦丁转化率增大。反应10 h时,芦丁转化率达41.8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件,并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。