表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型的建立及其在肿瘤DNA疫苗研究中的应用

本文工作的目的是建立以β-半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型,并进行肿瘤免疫的研究。我们首先在pcDNA3质粒中引入一个β-半乳糖苷酶编码基因从而建立转染质粒p3gal。p3gal转染小鼠黑色素瘤细胞B16后,再通过G418筛选及X-Gal细胞染色得到表达β-半乳糖苷酶的gal B16细胞株。接着用该细胞株成功地在C57小鼠上建立了表达β-半乳糖苷酶的gal B16肿瘤模型。并在此模型上观察了β-半乳糖苷酶编码基因作为DNA疫苗抑制gal B16肿瘤生长的作用。     

动物细胞培养及单克隆抗体

941449重组CHO细胞在其细胞周期中表达外源基因(β-半乳糖苷酶)[英]/Gu,M.B.…∥Biotechnol.Bioeng.-1993,42(9).-1113～1123[译自DBA,1993,12(25),93-14684] 用含二氢叶酸-还原酶基因(dhfr)和编码细菌β-半乳糖苷酶的LacZ基因的表达载体转染CHOβ-G72-16细胞,研究了单个该细胞中的外源蛋白     

受四环素调控的真核表达系统SK-Hep1细胞株的建立

建立稳定、高效表达外源基因的SK-Hep1细胞株,以便进一步研究基因的作用.首先将调控质粒pCDNA6/TR转染SK-Hep1细胞,经潮霉素筛选得到多个稳定单克隆.各个单克隆分别扩大培养后,转染pCDNA4/TO/lacZ质粒,再经过DOX(强力霉素)诱导表达,检测β-半乳糖苷酶(β-D galaetosidase,β-gal)活性,从而筛选出高诱导水平低背景表达的SK-Hep1 tet-on细胞株.最后,再将pCDNA4/TO/c-myc质粒转染进SK-Hep1 tet-on细胞株,进一步通过Western blotting检测该系统对下游基因的表达调控.成功建立了一株受DOX调控的高诱导水平低背景表达的细胞株SK-Hep1 tet-on 10#.     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定

目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型.方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定.构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株.采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化.建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤.结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光.胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型.结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具.     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

阳离子脂质体转染人类骨骼肌原代细胞的初步研究

探讨不同脂质体介导基因转染人类骨骼肌原代细胞的转染效率和基因的表达.将含有β-半乳糖苷酶LacZ结构基因的质粒,用三种不同的阳离子脂质体导入人类骨骼肌原代细胞中,通过X-Gal染色观察不同的转染效率.结果发现,Fugene 6转染效率最高,蓝染细胞达10%,其脂质体与DNA的最佳比例为3∶ 2.Fugene 6可有效地将外源基因导入骨骼肌原代细胞,而且外源基因可以长效高效地表达,有望用来作为基因治疗的载体.     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

糖尿病诱导硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)对小鼠胰岛β细胞衰老的影响*

目的: 本研究旨在观察糖尿病中硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的表达是否影响胰岛β细胞衰老。方法: 正常小鼠(db/m)、糖尿病小鼠(db/db)随机各取6只,血糖仪检测其空腹血糖值,Western blot检测胰腺组织TXNIP蛋白表达、免疫化学染色检测胰腺组织中衰老相关β-半乳糖苷酶活性,Western blot检测胰腺组织衰老相关指标p16、p21、Rb表达的变化。INS-1胰岛β细胞随机分7组(n=6),用各组慢病毒(30 μl)转染4~6 h后,嘌呤霉素(PM, 3 μg/m)筛选7 d,构建Normal组(正常组)、Scramble ShRNA组(干扰空病毒组)、TXNIP-ShRNA-1(TXNIP沉默一组)组、TXNIP-ShRNA-2(TXNIP沉默二组)组、TXNIP-ShRNA-3组(TXNIP沉默三组)、Ad-GFP组(过表达空病毒组)、Ad-TXNIP-GFP组(TXNIP过表达组)稳转INS-1胰岛β细胞株,检测其TXNIP蛋白表达、衰老相关β -半乳糖苷酶活性、衰老相关指标。结果: 与正常小鼠相比,db/db组小鼠空腹血糖显著上升(P＜0.01),胰腺组织TXNIP蛋白表达显著升高(P＜0.05),胰腺组织β -半乳糖苷酶阳性染色率增加,p16、p21、Rb蛋白表达显著升高(P＜ 0.05)。与Ad-GFP组相比,Ad-TXNIP-GFP组β -半乳糖苷酶阳性染色率增加,p16、p21、Rb蛋白表达均显著增加(P＜0.01)。与Scramble ShRNA组相比,TXNIP-ShRNA组β -半乳糖苷酶阳性染色率降低,p16、p21以及Rb蛋白表达均降低(P＜0.05)。结论: 糖尿病可通过上调TXNIP表达,诱导胰岛β细胞衰老。     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活行

构建重组FN多肽CH50真核表达载体并在小鼠体内表达,研究其趋化与抗肿瘤作用.采用重组DNA技术构建表达质粒;体内进行基因转染,采用RT-PCR鉴定导入基因的表达;通过肝素亲和层析、SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用.从CH50原核表达载体获得重组多肽的cDNA,5＇端加上小鼠IFN-γ5＇端非编码区和信号肽编码区的cDNA,3＇端加上人FN cDNA的3＇端非编码区;将重组cDNA插入pREP8质粒,即构建出pCH503质粒.巨噬细胞在体内经pCH503转染,然后在体外培养,能够产生CH50多肽.以pCH503分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染,均可对免疫细胞产生趋化作用;pCH503体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低50%～601.CH50真核表达载体pCH503可在小鼠体内表达,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成,在肿瘤综合治疗中有重要意义.     

人胰岛素基因的合成Ⅷ.表达型质粒的构建和在大肠杆菌内生产含胰岛素原的融合蛋白

我们已构建两组质粒,适合于在大肠杆菌内克隆基因和直接大量咸融合蛋白。这些质粒含有E.coli的lac启动基因和部分编码β-半乳糖苷酶的序列,编厔的蛋白长度约590或450个氨基酸殖基(原基因编码1023个氨基酸殖基)。被缩短的β-半乳糖苷酶基因的末端跟随一个多种限制性酶的接头序列;这个序列可被八种限制性酶中的任一种切断,然后插入任何蛋白基因。每组质粒有三种,可以满足所有三种不同的翻译读框。我们克隆了人工合成的入胰岛素原基因到这些质粒上去,在大肠杜菌内可以生产大量β-半乳糖苷酶残基—人胰岛素原融合蛋白。     

香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）通过分解细胞壁半纤维素切除半乳糖键而参与果实软化。为了阐明香蕉（Musasp．）果实成熟过程中的软化与细胞壁代谢酶β-半乳糖苷酶基因表达之间的关系,采用RT-PCR方法,从成熟香蕉果实果肉中分离了编码β-半乳糖苷酶基因的部分cDNA（MA-Gal）,序列分析表明,MA-Gal包含927bp,编码309个氨基酸,包含5个β-半乳糖苷酶结构域（典型真核生物中β-半乳糖苷酶包含7个结构域）,推导的MA-Gal蛋白质中有β-半乳糖苷酶蛋白的催化活性部位GGPIILSQIENEY（F）;系统进化树分析结果表明MA-Gal属于第一类β-半乳糖苷酶基因（该类主要在果实中表达）;β-半乳糖苷酶活性和硬度的变化表明其与香蕉果实硬度变化密切相关;Northern分析显示,跃变前期的果肉中,MA-Gal基因的表达量很低,后随着果实的软化表达量不断增加,并在呼吸跃变后达到最高。所有结果表明,MA-Gal参与香蕉果实成熟过程中的软化。     

草莓β-半乳糖苷酶基因FaTβgal的克隆与表达分析

利用SSH和RACE技术,从‘丰香’草莓果实中分离了1个草莓β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因,命名为FaTβgal。FaTβgal基因cDNA序列全长2 891bp,ORF区2 448bp,编码815个氨基酸,含有保守序列GGPIILSQIENEY和凝集素结构域。FaTβgal推导氨基酸序列与已报道的3个草莓β-Gal基因Faβgal1(CAC44500)、Faβgal2(CAC44501)、Faβgal3(CAC44502)氨基酸序列有47.1%~48.1%的相似性。与其它物种24个β-Gal基因聚类分析表明,FaTβgal聚在一个独立的分枝上。采用实时荧光定量PCR技术,对FaTβgal基因在果实发育成熟过程中的表达分析表明,该基因在果实中特异表达,随着果实成熟表达量升高,粉红期达到峰值,全红期迅速下降;2个软硬不同的品种表达模式趋于一致。研究认为,FaTβgal基因是β-Gal基因家族的一个新基因,该基因可能在果实成熟软化过程中发挥作用。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的：构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法：利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果：成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论：成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的:构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法:利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果:成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论:成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~rTc~s lac~ 转化体,得到另一个lac重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac的表达作了分析。     

乙型肝炎病毒蛋白对纤维介素基因的激活作用

纤维介素基因（fgl2）在人和小鼠的重型肝炎的发病机制中发挥重要作用.为探讨乙型肝炎病毒（HBV）编码蛋白对人纤维介素基因（hfgl2）的激活作用, 构建了HBV编码蛋白C、 S和X的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx, 分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒（βGal ）共转染到CHO细胞和HepG2 细胞, 采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达.通过检测报告基因荧光素酶（LUC）及β半乳糖苷酶的表达活性, 反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用.结果显示, 转染了真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白, 在CHO细胞, 转染pcDNA-HB组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的5.4和6倍, 在hepG2细胞, 转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍.研究表明, CHO和HepG2细胞中表达的HBV C蛋白和X蛋白均具有激活hfgl2的功能, 而S蛋白则不能激活.进一步揭示了HBV病毒蛋白与宿主基因的相互作用机制.     

海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达

本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因 (TM_0310).以海栖热袍菌基因组 DNA(GenBank登录号 AE000512)为模板,设计特异性引物带有 NcoI-HindⅢ酶切位点,克隆得到的该基因全序列为2019 bp,编码672个氨基酸,分子量为78.972 kD.该基因编码的蛋白质属于42族,根据氨基酸同源性分析,该β-半乳糖苷酶与 Thermotoga petrophila RKU-1 来源的假想的β-半乳糖苷酶(GenBank 登录号 ABQ46628.1)以及Thermotoga sp.RQ2来源的β-半乳糖苷酶(GenBank 登录号 EDQ29256.1)同源性最高,均为95%.重组转化子经诱导酶比活可达2.08 U/mg 蛋白.粗酶液经过80℃热处理10 min,酶活残留70%以上,表明该酶有很好的耐热性,在高温工业环境中有良好应用前景.     

基于活体成像的表达人PSCA抗原的小鼠肿瘤模型的建立

目的:探讨并建立可供药物评价或生物学功能研究的表达人PSCA抗原的荧光素酶小鼠肿瘤模型。方法:克隆人PSCA基因及荧光素酶基因luc,构建真核表达质粒pcDNA-PSCA及pcDNA-luc,共转染RM-1细胞株;照度计检测转染细胞的荧光素酶活性,RT-PCR及流式细胞术检测PSCA的表达,筛选出共表达荧光素酶及人PSCA的RM-PSCA/luc细胞株;将RM-PSCA/luc细胞接种C57BL/6小鼠,观察所致肿瘤的生长情况及小鼠存活状况,并对小鼠进行活体成像检测Luc的表达;采用免疫组织化学染色方法检测人PSCA在小鼠肿瘤组织中的表达。结果:筛选到了稳定共表达Luc及人PSCA抗原的RM-PSCA/luc细胞,接种实验小鼠全部成瘤,肿瘤生长迅速,小鼠平均存活38天;转染荧光素酶基因的肿瘤细胞生物特性稳定,活体成像仪检测到转染荧光素酶细胞在小鼠体内活体成像,荧光素酶表达活性的强弱能够反映肿瘤大小;免疫组织化学染色方法检测到小鼠肿瘤组织PSCA的表达。结论:成功构建了可用于活体成像表达人PSCA抗原的小鼠肿瘤模型,为相关肿瘤药物及疫苗的研发奠定基础。