广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中类心脏毒素物理化学性质的研究

前文我们报道了广西产金环蛇蛇毒中类心脏毒素a 及b 的分离。本文就它们的物理化学性质作了进一步研究。二种毒素氨基酸组成十分相似,通过凝胶过滤,测得它们的分子量分别为15,900和12,100。它们N 端的二个氨基酸顺序完全相同,为Gly·Leu…。经羧肽酶A降解测得它们的C 端顺序为……Ala·Cys·Tyr。等电聚焦测得它们的等电点分别为8.8和9.2。紫外吸收光谱显示它们279nmE_(1厘米)~(1%)分别为11.7和12.7。     

广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中类心脏毒素物理化学性质的研究

前文我们报道了广西产金环蛇蛇毒中类心脏毒素a及b的分离。本文就它们的物理化学性质作了进一步研究。二种毒素氨基酸组成十分相似,通过凝胶过滤,测得它们的分子量分别为15,900和12,100。它们N端的二个氨基酸顺序完全相同,为Gly·Leu…。经羧肽酶A降解测得它们的C端顺序为……Ala·Cys·Tyr。等电聚焦测得它们的等电点分别为8.8和9.2。紫外吸收光谱显示它们279nm E_(1厘米)~(1%)分别为11.7和12.7。     

金环蛇(Bungarus fasciatus Schneider)蛇毒的研究——Ⅰ.金环蛇蛇毒毒性组分的分离纯化与鉴定

金环蛇毒经羧甲基-葡聚糖凝胶C-50柱层析分离为几个主峰,其中Ⅷ、Ⅹ、ⅩⅢ、ⅩⅣ、ⅩⅤ及ⅩⅥ六个峰为主要致死成分。在大白鼠膈神经-膈肌及其他神经肌肉标本上用电生理方法检测蛋白含量较高的Ⅹ_2、ⅩⅢ_2、ⅩⅣ_2及ⅩⅥ_1峰的作用,观察它们对微终板电位、终板电位及肌膜电位的影响。此外,还检测它们的离体去神经肌肉标本对乙酰胆碱敏感性的影响。实验结果提示,ⅩⅣ_2峰及ⅩⅥ_1峰中含有作用于突触后的神经毒性组分,ⅩⅢ_2峰中含有细胞毒性组分,X_2峰中含有细胞毒性及突触前神经毒性作用组分。再经Bio Rex-70柱层析后,从ⅩⅢ_2峰中纯化得一个细胞毒素,从ⅩⅣ_2峰中纯化得一个突触后神经毒素,它们在8M 尿素聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳中呈单一区带。凝胶过滤法测得该细胞毒索的分子量为13200、神经毒素的分子量为7,900。细胞毒素的小白鼠静脉注射最小致死量为4.1微克/克,神经毒素为0.16微克/克。     

金环蛇类心脏毒素对两栖类肌肉膜电常数的影响

前一工作表明,从我国广东产金环蛇毒分离的类心脏毒素(即毒素 A 和 B)在一定浓度下引起两栖类和哺乳类动物的心肌,特别是骨胳肌的膜电位持续下降。本工作试图分析这种下降的机制。实验表明在毒素 A 或 B 的作用下,随着蟾蜍骨胳肌膜电位的下降,膜电阻也明显下降,但膜电容保持不变。这种膜电位的下降,不能为预先向溶液中加河豚毒素所防止,也不能为无钠溶液所延缓。这些结果提示,毒素 A 和 B 是通过增加可兴奋膜的通透性,而不是由阻塞 K~ 通道来引起膜电位下降的,也不是或主要不是通过 Na~ 通透性的增加而实现的。     

~(125)Ⅰ标记金坏蛇毒和类心脏毒素在小鼠体内的分布

将动物分成三组,分别皮下注射小于致死剂量的~(125)I标记金环蛇毒或二个类心脏毒素(毒素 A或 B),在注射后1、2、4、8、16和24小时测定了一些组织(或脏器)中的放射强度(脉冲数/min/mg 湿重组织)。结果表明,除血液放射强度在注射后1小时已达最高值外,其余均在注射后2小时达到或接近最高值。至于三者从动物体内的排除,则毒素 B 似较快,如它在各组织中的放射强度在注射后8小时已降到接近对照水平,而毒素 A 和粗毒一般都在注射后16小时方降到对照水平,甚至还稍高于对照水平。注射后2小时,三种被标记物质在各组织中的放射强度均以肾为最高。如以肾的放射强度为100%计算,则肺、肝和脾的为3.5%,心肌、膈肌和骨胳肌的为1—2%,脑的最低,仅为0.3—0.5%。这些结果和 Lee 等报道的有关银环蛇毒在体内分布的资料相似。未观察到粗毒或二种纯化毒素在某一种组织中有特殊的积聚,用放射自显影法也未能显示毒素 A 或 B 在神经肌肉接头有明显的集中。     

Sepharose 4B一步法对金环蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化

利用经酸处理的Sepharose 4B为层析介质,以含0.2mol/L半乳糖,pH7.4台氏液作为洗脱液,从广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中一步分离得到一种磷脂酶A2.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为14 kDa.N端部分序列测定表明,所分离得到的磷脂酶A2其N端16个氨基酸残基序列与已报道的金环蛇蛇毒磷脂酶A2同功酶Ⅵ(Lu & Lo,1978)一致.该酶糖含量较高,为13.4%;具有弱的磷脂酶A2活性,无毒,也无溶血和出血毒活性.     

竹叶青蛇毒血小板聚集剂的分离纯化及生化特性

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤和ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑ阴离子交换柱层析及Ｓｕｐｅｒｏｓｅ－１２凝胶过滤。从竹叶青蛇的蛇毒中纯化到一个能诱导人血小板聚集的均一组分。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为６８０００左右。等电点为４．３。测定了它的氨基酸组成。对它活化血小板的作用机理进行了初步研究,结果表明它是一种强的血小板激动剂。     

竹叶青蛇毒血小板聚集剂的分离纯化及生化特性

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤和ＦＰＬＣＭｏｎｏＱ阴离子交换柱层析及Ｓｕｐｅｒｏｓｅ－１２凝胶过滤,从竹叶青蛇的蛇毒中纯化到一个能诱导人血小板聚集的均一组分．经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为６８０００左右．等电点为４．３．测定了它的氨基酸组成,对它活化血小板的作用机理进行了初步研究,结果表明它是一种强的血小板激动剂．     

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素的纯化与部分性质

目的　被尖吻蝮蛇 （ Ｄｉｅｎａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ａｃｕｔｕｓ） 咬伤会引起严重的出血, 对蛇毒出血毒素的研究有利于治疗蛇伤出血药物筛选。 方法　采用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５, Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０, Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００ 和两次 Ｐ Ｂ Ｅ 聚焦层析纯化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和等电聚焦电泳测定纯化样品的纯度和等电点。氨基酸组成用自动氨基酸分析仪测定。以小鼠背部皮下注射部位出血斑的面积来确定最小出血剂量和常规的方法测定酶活性。结果　从尖吻蝮蛇毒中纯化到一个相对分子量为５６ ０００ 的出血毒素 （ Ｄａ Ｈ Ｔ３）, 经氨基酸组成测定计算,它由 ４８７ 个氨基酸残基组成。此成分在 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ上显示出一条均一的蛋白染色带, 其ｐ Ｉ为５５０。该出血成分的最小出血剂量是 ２６μｇ, 具有蛋白水解酶活力, 其活力为 ３６８, 但没有精氨酯酶和磷脂酶 Ａ２ 活力。当加入 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 螯合剂去除金属离子后, 它们的出血活力和蛋白水解酶活力均丧失。 结论　这是从大陆尖吻蝮蛇毒中获得的一个新的出血金属蛋白酶 （ Ｄａ Ｈ Ｔ３）。     

蛇毒心脏毒素对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用初步研究

目的探讨蛇毒心脏毒素（ＣＴＸ）对荷瘤小鼠Ｓ１８０腹水瘤细胞生长抑制的影响。方法小鼠腹腔接种Ｓ１８０活瘤细胞,连续１０ｄ分别腹腔注射ＣＴＸ０．８ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ,分析统计荷瘤小鼠的体重变化和癌细胞死亡率,并用有丝分裂完全阻断法分析体内癌细胞的有丝分裂过程。结果ＣＴＸ各剂量组荷瘤小鼠的体重抑制和癌细胞死亡率均有明显的剂量反应关系,与对照组相比有显著的差异（Ｐ＜０．０１）;镜检发现ＣＴＸ能抑制体内癌细胞的有丝分裂,表现在０．４ｍｇ／ｋｇ和０．８ｍｇ／ｋｇ实验组腹水Ｓ１８０细胞处于有丝分裂前期和中期的细胞数量明显减少,其ＭＩ值分别为０．７１％和０．８０％,比对照组显著减少（Ｐ＜０．００１）。结论ＣＴＸ对Ｓ１８０小鼠体内癌细胞的生长有抑制和杀伤作用,并通过干扰和阻断癌细胞的有丝分裂过程,抑制腹水的生长。     

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素DaHT-3的纯化与性质

被尖吻蝮蛇咬伤会引起严重的出血,对蛇毒出血毒素的研究有利于治疗蛇伤出血药物的筛选.通过SephadexG-75,DEAE-SephadexA-50,SephadexG-200和两次PBE聚焦层析,从尖吻蝮蛇(Dienagkistrodonacutus)蛇毒中纯化到一个分子量为56000的出血毒素(DaHT-3),经氨基酸组成测定计算,由487个氨基酸残基组成.此成分在SDS-PAGE上显示出一条均一的蛋白染色带,用等电聚焦电泳测定,其pI为5.50.该出血成分的最小出血剂量是2.6μg,具有蛋白水解酶活力,其活力为3.68,但没有精氨酸酯酶和磷脂酶A2活力.用红外光谱仪研究DaHT-3在溶液中酰胺I带的吸收谱,该毒素含有31.8%的α螺旋、56.1%的β折叠和12.1%的转角;当加入EDTA螯合剂去除金属离子后,它们的α螺旋、β折叠、转角和无规卷曲分别变为11%、26.4%、46.2%和16.5%,而出血活力和蛋白水解酶活力均丧失,表明该出血毒素是金属蛋白酶     

五步蛇蛇毒的分离纯化及综合利用

五步蛇蛇毒冻干粉经过SephadexG-75分子筛层析,使纤溶酶和类凝血酶初步分离;DEAE阴离子交换层析对2种酶进一步分离纯化,分别得到了纤溶酶和类凝血酶。2种酶在HPLC图谱上均呈单一峰,在SDS-PAGE图谱上均为单一条带,纤溶酶分子量大约为24．1kDa,类凝血酶分子量大约为14．4kDa,与以往报道相符。酶的总活力回收率大大提高,纤溶酶的活力回收率达23．9％,类凝血酶的活力回收率达34．5％。实现了对蛇毒的综合利用,为进一步开发利用蛇毒探索了一条有效的途径。     

五步蛇毒中低分子量蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 寻找五步蛇毒新的蛇毒类凝血酶组份。方法 用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（－ＦＦ）,ｃｍ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＦＦ纯化经常规化学提纯的五步蛇毒;以血凝活性和精氨酸酯酶活性（ＢＡＥＥ）检测酶活力;以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳法测定分子量。结果 得到分子量为１４０００左右的电泳纯蛇毒类凝血酶组份。结论 五步蛇毒中含有低分子量蛇毒类凝血酶。     

蛇毒心脏毒素对动物细胞的遗传损伤和生殖毒性研究

目的 应用眼镜蛇毒心脏毒素（ＣＴＸ）作用于小鼠的骨髓细胞和生殖细胞,以探讨ＣＴＸ对动物体的生殖毒性和遗传毒性。方法 对小鼠腹腔注射不同剂量ＣＴＸ,通过生殖毒性实验和致突变实验,分析孕鼠的胚胎存活率,骨髓细胞和精母细胞的染色体畸变率。结果：ＣＴＸ能影响胎鼠的生长发育,使孕鼠的增重和活胎率均明显地降低（Ｐ〈０．００１）,染色体畸变实验显示ＣＴＸ０．４ｍｇ／ｋｇ剂量上精母细胞多倍体和非整倍体细胞数目增高     

松江鲈(Trachidermus fasciatus)凝血因子Ⅺ的基因克隆与表达分析

克隆松江鲈凝血因子XI基因cDNA序列,分析表达模式。利用RACE技术从松江鲈中克隆获得了凝血因子XI的cDNA全长序列(命名为TfXI),并对其进行生物信息学和表达模式分析。获得TfXI cDNA全长1 287 bp,包括13 bp的5'端非编码区,1 143 bp的开放阅读框以及131 bp的3'端非编码区。开放阅读框编码280个氨基酸的多肽链,预测的蛋白大小为42.9 kD。N端含有由第22-105位氨基酸,112-196位氨基酸、205-279位氨基酸和289-369位氨基酸形成的4个串联排列的典型APPLE结构域。NCBI Blast结果显示TfXI与其他物种凝血因子XI的相似性为30%-63%,进化树分析显示,TfXI符合传统进化规律。Realtime PCR分析表明,经LPS刺激96 h后,松江鲈脾脏TfXI表达量明显提高(P0.01)。     

蓝色染料配基亲和纯化眼镜蛇心脏毒素的研究

探索了蓝色染料（Cibacron Blue F3G-A）亲和分离中华眼镜蛇心脏毒素的可能性。采用环氧基活化法制备蓝色染料亲和介质,中性条件下提取眼镜蛇粗毒中的心脏毒素。Tricine系统SDS-PAGE多肽电泳和Lowry法蛋白定量分析纯化效果,发现蓝色染料琼脂糖一步纯化中华眼镜蛇心脏毒素的纯度达到84%,结合量为6.9mg/ml介质。这是首次利用小分子亲和配基纯化心脏毒素。与生物大分子配基相比,活性染料分子具有价格便宜,易于合成,性质稳定,不易降解和适合大规模生产等优点。     

Vero毒素—1的纯化及特性分析

从含有VT1全基因的基因工程菌中纯化出VT1。纯化的步骤包括（NH4）2SO4盐析,两次DEAE Sepharose Fast Flow柱层析。最终从4L培养物中纯化出1.5mg纯毒素,收率为8．6％,梯度Native-PAGE测定毒素的分子量为70kD,SDS－PAGE电泳表明毒素有两个亚基,分子量分别是32kD和7.7kD。对VT1的多种生物学特性进行了研究;经测定VT1对Vero细胞的半数致死量CD50为1pg,对小鼠的半数致死量LD50为18ng,引起兔肠襻积液的最小毒素量是1．25μg/肠襻。     

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒神经生长因子的分离纯化和特性

神经生长因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗ ｔｈ ｆａｃｔｏｒ, Ｎ Ｇ Ｆ）是第一个被发现,也是迄今为止研究得最为清楚的一种神经营养因子 利用 Ｐ Ｃ１２ 细胞生物活力测定为跟踪检测手段,分别经过 Ｃ Ｍ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ Ｌ ６ Ｂ、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５ 及 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ ｍ ｏｎｏ Ｓ层析,从３０ ｇ 江浙蝮蛇粗毒中分离纯化到２００ μｇ Ｎ Ｇ Ｆ,纯化倍数高达１０５经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 测定,该蛋白分子量为 ２６ ｋ Ｄ,由两个亚基通过二硫键交联组成二体形式等电聚焦显示其等电点为６７,与氨基酸组成分析结果相吻合 江浙蝮蛇神经生长因子的生物活力水平与小鼠２５ Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ相当,在１～１００ μｇ／ Ｌ 的浓度范围内维持 Ｐ Ｃ１２ 细胞在无血清条件下的存活     

烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶研究 Ⅰ分离纯化及理化性质(英文)

通过DEAE-SephadexA-50,DEAE-SepharoseCL-6B,MonoQ （FPLC）三步离子交换柱层析,纯化得到一新的纤维蛋白原溶酶,在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上均呈单一的蛋白带。分子量为2600,等电点pl4.7;它是一个糖蛋白,含糖量6.4%,其中中性糖0.3%,已糖胺4.9%,唾液酸1.2%。烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg由187个氨基酸组成,含有较高的酸性氨基酸,此外甘氨酸含量也较高。TMVFg热稳定性强,而酸不稳定,在280 nm处具有典型的蛋白吸收峰,在无离子水中紫外消光系数E0.1%/280 nm=1.558。纯化的TMVFg具有较强的精氨酸酯酶活力,对苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）的Km值为1.4×10[-3]M。TMVFg的活性受苯甲基丹磺酰氟（PMSF）抑制;乙二胺四乙酸（EDTA）对活性无影响。TMVFg不能使纤维蛋白原凝固,但能水解纤维蛋白原α、β链。纤溶实验表明TMVFg具有激活纤溶作用。纯化的烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶对酪蛋白无作用,无出血活性,因而与凝血酶样酶、出血毒素及β-纤维蛋白原溶酶（OUYANG et al.,1977）明显不同。