三核苷酸重复序列失稳定机制:重复序列形成non-B二级结构的必要性和细胞反式作用因子的作用

与三核苷酸重复序列CAG.CTG、CGG·CCG和GAA·TTC扩增和缺失有关的分子机制尚不能得到清楚的阐释.体外研究表明,上述疾病相关的重复序列可以在体外形成non-B二级结构,并介导重复序列扩增.然而,迄今为止,类似的观察尚未在体内研究过程中得以实现.利用模型生物大肠杆菌和酵母等进行的有关研究并不能模拟三核苷酸重复序列的扩增,这暗示三核苷酸重复序列的体内扩增可能与重复序列形成non-B二级结构关联性并不大.尽管理论上较长的三核苷酸重复序列可以在复制和后复制过程中较易形成non-B DNA二级结构,但这样的二级结构倾向于导致重复序列出现"脆性",而不是扩增.事实上,患者所具有的三核苷酸重复序列扩增并非一定需要通过non-B二级结构的介导,这些重复序列的扩增是可以通过一种RNA转录诱导的局部DNA重复序列的复制和其后的DNA重排得以发生.     

两个亨廷顿舞蹈病家系IT15基因的研究

为了探讨亨廷顿舞蹈病家系患者的临床特征与IT15基因中(CAG)_n重复拷贝数之间的相互关系, 对两家系患者的临床、影像学特征、发病年龄及遗传方式等进行分析; 用聚合酶链反应技术、6%聚丙烯酰胺凝胶电泳及直接测序等方法, 对42名家系成员的IT15基因的(CAG)_n三核苷酸重复序列进行分析。结果显示家系1患者无典型的临床“三联症”及尾状核的萎缩, 18名家系成员中9名患者IT15基因的(CAG)_n拷贝数介于40~50次之间,拷贝数与发病年龄无明显相关; 而家系2患者具有典型的“三联症”和尾状核的萎缩, 24名家系成员中5例患者(CAG)_n拷贝数大于等于50次, 发病年龄与(CAG)_n拷贝数相关。因此亨廷顿舞蹈病患者的临床特征在一定程度上受IT15基因的(CAG)_n三核苷酸重复拷贝数的影响, 拷贝数大于50次, 发病年龄与(CAG)_n拷贝数相关, 并有经父系遗传的(CAG)_n拷贝数的扩展, 且存在遗传早现现象。     

亨廷顿病的基因诊断

为了简单高效检测HD基因开放阅读框5’端(CAG)ｎ三核苷酸重复序列,建立快速准确的亨廷顿病(Huntington disease, HD)基因诊断方法,应用TaKaRa LA Taq DNA聚合酶配合GC buffer扩增HD基因包含(CAG)ｎ重复序列的目的片段,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后回收(CAG)ｎ拷贝数异常增多的目的片段,再次PCR扩增后将产物连接至T载体,进行DNA测序确定CAG的拷贝数。应用该方法对一个HD家系的3名成员以及20名正常人进行基因诊断,结果显示该HD家系3名成员的一条染色体上的(CAG)ｎ拷贝数在正常范围内,而另一条染色体上的(CAG)ｎ拷贝数异常增多,分别为39、40、41,而20例正常人(CAG)ｎ拷贝数均在正常范围内,正常和HD等位基因之间的(CAG)ｎ拷贝数不相重叠。因此,应用该方法可以对HD进行准确的基因诊断,结果同时也证明HD基因的动态突变是导致中国人亨廷顿病的遗传基础。     

中国丙型肝炎患者中发现新的丙型肝炎病毒核苷酸序列

应用RT-PCR和DNA克隆重组技术,从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到3个丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(5'NCR)核苷酸序列.这3个序列分别来自3个不同的丙型肝炎患者.与国内外已发表的HCV原型株同源序列比较研究发现,这3个HCV 5'NCR序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复.在YS225-1 5'NCR序列-155～-174位之间,有18个核苷酸序列缺失;在YS203-4和YS242-1 5'NCR序列-55～-56位之间,分别有28个(YS203-4)和40个(YS242-1)核苷酸序列插入.这些插入序列(28个核苷酸)在其相邻部位已有存在,即为重复序列.YS242-1插入序列中有11个核苷酸出现两次重复.其它部位的核苷酸变异也同已知基因型的相应核苷酸变异有很大差异.结果表明,这3个序列是迄今为止国内外都未曾发现过的新的HCV核苷酸序列.     

鲫鱼Hind Ⅲ高重复DNA序列的分子克隆

基因组DNA高重复序列的研究有助于解释许多重要的生命现象 ,如基因调节、基因转座、基因进化等 ,还可以用于进行种群的遗传分析。鱼类的DNA高重复序列研究资料较少 ,曾在鲤科鱼类发现HindⅢ高重复序列家族。本研究用HindⅢ内切酶消化 ,从鲫鱼 (Carassiusauratusauratus)基因组DNA也克隆出一种独特的高重复序列。序列测定揭示该重复序列长度为 175bp ,在单倍体基因组的拷贝数为 1× 10 5。鲫鱼HindⅢ高重复序列与鲫鱼属 (Carassius)其它同类已知的高重复序列存在某种程度的变异 ,而与鲤科其它属的已知的HindⅢ高重复序列完全不同     

拷贝数变异: 基因组多样性的新形式

基因拷贝数变异是指DNA片段大小范围从kb到Mb的亚微观突变, 是一可能具有致病性、良性或未知临床意义的基因组改变。Fosmid末端配对序列比较策略、比较基因组杂交芯片是当前较多使用的检测手段。染色体非等位的同源重排、非同源突变和非b DNA结构是造成基因组拷贝数变异的重要原因。拷贝数变异可导致不同程度的基因表达差异, 对正常表型的构成及疾病的发生发展具有一定作用。文章在总结基因拷贝数变异的认识过程和研究策略的基础上, 分析了拷贝数变异的形成和作用机制, 介绍了第一代人类基因组拷贝数变异图谱, 阐述了拷贝数变异研究的临床意义, 提示在探索疾病相关的遗传变异时不能错失拷贝数变异这一基因组多样性的新形式。     

石刁柏EST序列中微卫星分布特征分析

目的:开发新型石刁柏EST - SSR分子标记和开展相关的分子生物学研究.方法:利用EST - trimmer、Repeat Masker、SSRIT等生物信息学分析工具对石刁柏EST数据库中的EST序列进行去除poly A/T尾,载体、重复序列和低质量序列处理,并对EST序列中SSR分布特征进行了分析.结果:在NCBI数据库中下载的8 565条石刁柏EST序列中,重复次数超过5次的SSR共有610个,其中分布于601～ 800bp的EST - SSR标记最多,共464个,占SSR总数的77.33％;主要SSR重复基元类型是二核苷酸,共426个,占SSR总数的69.84％,其次是三核苷酸占SSR总数的29.18％.四核苷酸和五核苷酸的SSR仅各3个.结论:石刁柏EST中存在丰富的SSR信息,其中二核苷酸的AG/TC、GA/CT以及三核苷酸的CTT/GAA是SSR主要的重复单元.     

简单重复DNA序列在哺乳动物mtDNA D-loop区的分布及进化特征

简单重复序列广泛分布于从原核到真核生物的基因组中, 其形成的分子机理目前尚不明确。对NCBI数据库中已有256种哺乳动物线粒体DNA (mtDNA) D-loop区进行序列比对分析, 根据其所含有的简单重复序列类型分为3组, 分别是53种哺乳动物含有六核苷酸重复序列; 104种哺乳动物含有非六核苷酸重复序列(＞6 bp); 99种哺乳动物不含有任何重复序列。通过碱基序列分析比对, 发现六核苷酸重复序列集中分布在CSB1-CSB2间隔区, 而非六核苷酸重复可以分布于终止区(TAS)、中央保守区(Central domain)以及CSB(Central sequence block)区。通过比较含有重复序列与不含重复序列的功能保守区发现, 简单重复序列的存在并不明确影响D-loop区内的中央保守区以及CSB1、CSB2、CSB3三个功能保守区的碱基序列保守性。在此基础上, 利用N-J法构建了256种哺乳动物的进化树, 分析了哺乳动物D-Loop区内重复序列在进化过程中的可能变化规律, 发现简单重复序列随着物种的进化地位的升高而呈现消失趋势。     

基于锚定PCR技术对10种重要农业害虫微卫星DNA位点的筛选及其特征分析

微卫星DNA广泛存在于真核和原核生物的基因组中,具有多态性丰富、易于检测等特点,在遗传图谱的构建、动植物遗传学育种等方面被广泛应用。利用5′锚定PCR技术对桃小食心虫、桃蛀螟、玉米螟、二点委夜蛾、花蓟马、黄胸蓟马、棕榈蓟马、斑翅果蝇、稻水象甲、扶桑绵粉蚧10种重要农业害虫进行微卫星DNA筛选,并分析各个物种的微卫星DNA的特点。不同物种的阳性克隆率、微卫星比率、克隆效率和冗余率存在不同程度的差异;在核苷酸碱基数目上,主要为二核苷酸重复序列,占重复位点总数的93．2％～100％,三、四核苷酸重复位点较少。在二核苷酸重复位点中, CA/TG重复位点最为丰富,占重复位点总数的89．2％～100％。这与使用的锚定引物密切相关;10种害虫的微卫星DNA平均重复次数为6．7～8．9次,其中玉米螟具有最高的微卫星DNA重复次数（34次）;在序列类型上,完全型序列占上述害虫序列总数的91．0％～100％。5′锚定PCR技术能够快速挖掘害虫的微卫星DNA位点,本研究结果为这些害虫微卫星位点的进一步利用奠定了基础。     

Excel平台的EST-SSR分析方法

科学工作者在分析EST-SSR特性时需要许多手工操作,这是一个耗时而又容易出错的工作。本文介绍了以Excel平台来计算核苷酸数目、计算特定碱基数量和比例、合并SSR重复基元、筛选基元的重复记录、统计基元的总重复数、计算基元在SSR中最大或最小重复数、截取特定核苷酸序列等方法,这样可以提高分析的效率和准确性,同时对其他DNA或蛋白质序列分析有借鉴作用。     

花椰菜花叶病毒(新疆分离物)基因组DNA的全部核苷酸序列

用Maxam-Gilbert化学切断法,从含全长病毒DNA的克隆pCaMV C17中,测定了CaMV-XJ基因组的全部核苷酸序列。CaMV-XJ DNA含有8,060个碱基对。在不同的译读相位中,CaMV基因组含有6个主要ORF或可能的基因,与其他巳作全序列测定的三个CaMV分离物比较,有三个显著的差别;(1)ORFⅥ编码的氨基酸变化达16％,显著高于其他区域的变化和其他三个分离物之间的差别,(2)在ORFⅣ的近氨基末端有39bp的插入,它与被插入区的序列几乎是直接重复;(3)由于核苷酸置换而引入了终止信号,所以T.Hohn[2]推测,可能存在的ORFⅦ不可能编码有功能的蛋白。     

细菌基因组重复序列PCR技术及其应用

细菌中散在分布的DNA重复序列近年来不断被报道,基因外重复回文序列和肠细菌基因间共有重复序列是两个典型的原核细胞基因组散在重复序列。重复序列在染色体上的分布和拷贝数具种间特异性,用它们的互补序列作为引物,以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增反应,反应产物的琼脂糖电泳可以提供非常清晰的DNA指纹图谱,使用此图谱既可对各种微生物进行快速分型及鉴定,又可对它们进行DNA水平上的遗传多样性分析。细菌基因组重复序列PCR技术具有简捷、快速、结果稳定等特点,可对细菌进行分子标记,用于菌株分型、分类鉴定和亲缘关系等方面的研究。     

耐药淋球菌相关核苷酸序列的克隆与初步分析*

为克隆淋球菌染色体耐药相关核苷酸序列,我们利用抑制性消减杂交技术构建耐药性淋球菌与标准参考菌株差异DNA消减库,从中筛选淋球菌耐药相关核苷酸序列。通过初步筛选,对克隆得到的DNA片段进行测序,经GenBank和淋球菌基因组序列库检索分析,发现5个未知新核苷酸序列。这些核苷酸序列可能与淋球菌染色体耐药性相关,将为研究淋球菌耐药性提供新的实验对象。     

八肋游仆虫一种富含三核苷酸重复序列的新基因GARP的克隆与序列分析

人类基因中三核苷酸重复序列拷贝数的异常扩增, 可导致多种神经系统疾病。一种富含GAA三核苷酸的GARP (glutamic acid-rich protein)基因从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)大核文库中筛选获得。大核中该基因的染色体全长460 bp, 基因两端具有下毛类纤毛虫大核特有的端粒序列(C₄A₄C₄A₄C₄A₄C₄), 开放读框内含有一个TGA_(88-99)密码子, 在游仆虫中编码为半胱氨酸。经DNA Star 软件分析, 该基因编码的蛋白质由112个氨基酸组成, 预测其分子量为13 kDa, 等电点为3.82, 含有四个 [[alpha]] 螺旋和一个 [[beta]] 折叠。小核中对应的该基因含有两个内部删除序列, IES1 和IES2。IES1和IES2分别长41 bp, IES1以GA二核苷酸直接重复为删除信号, IES2以TA二核苷酸直接重复为删除信号。RT- PCR 证明该基因具有转录活性。     

昆虫杆状病毒的增强子(Enhancer)

人们早已发现,许多真核细胞DNA、动物病毒DNA和RNA肿瘤病毒基因组具有一种基因调控序列,能增加它所连接基因的转录效率,这种核苷酸序列称之为增强子或激活子(Enhancer或Activator)。最近,美国科学家Guarino和Summers等人首次发现昆虫杆状病毒苜蓿尺蠖丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus,AcNPV)基因组中有散在分布的增强子序列。它们是一种特殊方式的核苷酸重复序列,可大大增加病毒延迟早期基因(Delayed-Early Gene)的转录效     

三链形成寡聚核苷酸的反基因作用机理

1957年Felsenfeld等发现一条Poly A链能跟两条Poly U链形成三螺旋,这是三链形成寡聚核苷酸(triple-forming oligonucleotide,TFO)研究的开始[1].随着DNA合成技术的进展,人们能合成各种序列的寡聚核苷酸.1987年Le Doan等[2]发现聚嘌呤或聚嘧啶寡聚核苷酸能序列特异的结合于同聚嘌呤/同聚嘧啶DNA双链的大沟内,识别的机制包括形成Hoogsteen和反Hoogsteen氢键.现在常用的包括含(G、A),含(G、T)或含(C、T)的3种TFO以及它们的类似物.人们根据TFO能序列特异的识别双螺旋DNA,从而可能影响基因的转录而发展出反基因战略.     

有尾噬菌体目中微卫星和复合型微卫星的发生及分析

简单重复序列亦称微卫星,被成功应用于许多真核生物、原核生物和病毒的基因组和进化研究,但是噬菌体中的微卫星目前很少被研究。因此对60条尾病毒目基因组中的微卫星和和复合型微卫星(由两个或两个以上直接相邻的微卫星组成)做综合性分析,在这60个基因组中总共观察到11 874个微卫星和449个复合型微卫星。相关性分析表明微卫星个数与基因组大小成正线性相关(ρ=0.899, P<0.01)。参考序列中的微卫星个数少于对应的随机序列中微卫星个数,这种反常现象主要是因为参考序列含有较少的单核苷酸和二核苷酸重复。A/T和AT/TA重复是单核苷酸和二核苷酸重复中最主要的类型,因此单核苷酸重复中的GC含量明显低于相应的序列中的GC含量;相比之下,微卫星中的二核苷酸和三核苷酸重复的GC含量与对应的参考序列的GC含量无明显区别。尾病毒目基因组中的这些结果与其它生物体基因组存在一定的差别。有助于了解尾病毒目中微卫星的分布、进化和生物学功能。     

利用序列比较寻找胰岛素基因表达启动区与DNA结合蛋白的结合位点

NDFl、IPFl和HNF4是与胰岛素基因表达有关的DNA结合蛋白,通过比较SWISSPROT蛋白质数据库中人类、小鼠、大鼠这三种核蛋白氨基酸一级序列、模体和结构域,发现其结构十分相似,根据蛋白质结构和功能的关系,推测这些DNA结合蛋白与胰岛素基因结合的核苷酸序列相似;从GenBanl(核酸数据库中获得人类、小鼠、大鼠胰岛素DNA序列,用ClustalW比较三者Promoter区的核苷酸序列,显示有一段核苷酸序列较为相似,同时搜索TRANSFAC基因转录数据库中NDFl、IPFl和NHF4蛋白核苷酸结合位点,发现核酸比对保守的部分序列与TRANSFAC数据库中这三个转录因子的DNA结合位点一致,另外一些核酸保守序列可能为其他未知DNA结合蛋白的结合位点。这种核酸序列比对设计为分子生物学实验寻找和验证胰岛素DNA结合蛋白与核苷酸的结合位点提供了简单而实用的方法。     

DNA动力学柔性的统计力学模型

考虑碱基对之间的非紧邻相互作用、涨落的序列依赖效应和非对称涨落,提出了DNA构象的统计力学模型,给出了DNA柔性的新定义。作为模型的应用,对12种三核苷酸重复序列的动力学柔性作了预测。理论预测与其它方法得到的结论比较,有很好的一致性。对模型和结论的理论意义作了讨论。     

人类多种疾病中mtDNA拷贝数的变化

线粒体是细胞能量和自由基代谢中心,在细胞生命活动中发挥着重要作用,而mt DNA拷贝数是决定线粒体功能的重要因素。由于mt DNA缺乏组蛋白的保护和损伤修复系统,又暴露在氧化磷酸化产生的高氧环境中,易受损引起拷贝数变化,从而影响线粒体的功能。大量研究表明,多种疾病的发生发展与mt DNA拷贝数变化密切相关。该文综述了癌症、神经退行性疾病、心脑血管疾病、精神疾病等各种疾病中mt DNA拷贝数的变化情况,以期从中发现疾病相关mt DNA拷贝数的变化规律和调控机制。