全基因组蛋白质的标签细胞和小鼠资源库建设

小鼠是最广泛使用的模式生物,构建基因改造的小鼠模型是研究基因功能和疾病发生机制的重要手段.从20世纪80年代发展至今,小鼠基因改造技术更新迭代,主要包括胚胎干细胞介导的同源重组策略、配子介导的转基因策略、以及最新基于CRISPR/Cas9技术的遗传改造策略等.由我国科学家自主研发的全新小鼠基因改造技术——"人造精子细胞...     

基因改造家兔在动脉粥样硬化研究中的应用

目前应用转基因和基因敲除小鼠的研究工作几乎成为各种国际高水平学术刊物的主流,而基因改造的家兔由于其独有的特点,在心血管研究中占有重要地位。本文从基因改造小鼠的最新研究进展着手,分析了基因修饰小鼠在动脉粥样硬化研究中的局限性,进而阐明基因改造家兔用于动脉粥样研究的优越性及研究近况。文章分析表明基因改造家兔技术及其应用必将在生物医学研究中发挥重要作用。     

CRISPR-Cas介导的基因编辑工具

近年来,随着人们对CRISPR-Cas系统研究的不断深入和改造,CRISPR-Cas系统已成为一项新的基因靶向修饰技术,能够定向对靶基因进行定向沉默,目前该项技术已经成功地用于HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株,在小鼠、果蝇等模式动物上成功构建了基因敲除模型。CRISPR-Cas以其设计简单,耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔应用前景的基因靶向敲除技术。就CRISPR-Cas的发现、结构、作用机理以及Cas9/gRNA目前的一些应用进行综述。     

基因剔除小鼠研究的新进展

基因剔除小鼠是活体内研究基因及蛋白质功能的理想动物模型。传统的基因剔除技术存在表型分析复杂、周期长、操作繁杂等缺点,如何更科学、更方便地建立基因剔除小鼠模型成为目前使该技术更好地应用于医学研究的关键。本文从胚胎干细胞（ES细胞）的遗传背景、组织特异性基因表达基因剔除小鼠及基因剔除技术上的革新几方面介绍了目前基因剔除小鼠研究的一些最新进展。     

通过高效基因编辑技术构建小鼠 Rnf148 基因敲除模型

众所周知,利用同源重组原理,对DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)引起的基因损伤进行修复是早期研究人员用于制造基因突变小鼠的方法之一(Capecchi,1989)。但由于其效率低以及消耗时间过长而被锌指核糖核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)所取代(Bibikova et al.,2002;Moscou and Bogdanove,2009)。然而,ZFNs和TALENs也并非最优基因修饰技术,两者因其步骤复杂和细胞毒性,运用受到限制。近年来,已逐步被一种新基因编辑技术CRISPR/Cas9所代替。CRISPR/Cas9最初起源于细菌的自我防御系统,是近年运用于细胞和动物模型基因改造的主要方法,可以快速而高效获得基因敲除模型。泛素化系统是机体维持正常生物功能的蛋白降解系统,也是近年的研究热点,睾丸特异表达基因Rnf148是泛素化连接酶家族成员之一。为此,我们运用cas9技术构建小鼠Rnf148基因敲除模型,以进一步研究其在小鼠生精过程中的作用。通过针对Rnf148基因外显子设计特异的sg RNA(short guide RNA),与Cas9 m RNA共显微注射小鼠受精卵,我们成功获得了Rnf148的F0代敲除小鼠,将其与野生型小鼠交配,进一步成功获得了纯合Rnf148基因敲除小鼠。因此,利用cas9技术确实可以获得基因敲除鼠用于后续研究。     

肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)敲除和人源化小鼠模型的建立

目的 建立肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)基因人源化小鼠模型,同时建立TNFRSF4基因敲除小鼠模型,为针对TNFRSF4靶点的肿瘤治疗性抗体研发和筛选提供有效的小鼠模型,并为研究TNFRSF4在免疫过程中的作用机制提供小鼠模型.方法 利用CRISPR/Cas9技术,建立TNFRSF4基因人源化和敲除小鼠...     

Tbx18对小鼠心脏冠状血管及室壁结构发育的影响

利用Tbx18谱系示踪小鼠模型及Tbx18条件性基因敲除小鼠模型,探讨转录因子Tbx18对小鼠心血管结构发育的影响.实验建立Tbx18-Cre/Rosa26R-EYFP和Tbx18-Cre/Rosa26R-Lac Z两种基因敲入谱系示踪小鼠模型和Tbx18:Cre/Cre基因敲除小鼠模型;通过免疫荧光及X-gal染色技术,示踪Tbx18在心血管系统结构形成中的命运;通过小鼠心脏整体血管免疫组化及切片HE染色、免疫组化、免疫荧光技术,比较Tbx18:Cre/Cre基因敲除小鼠与野生型对照小鼠心脏室壁结构及冠状血管结构发育情况.示踪结果提示,Tbx18参与小鼠冠状血管及室间隔结构的形成,并与冠脉平滑肌细胞共表达;对Tbx18基因敲除小鼠及野生型小鼠的心脏结构比较提示,Tbx18基因敲除后,仍能形成形态正常的冠状血管系统,小鼠心室肌及室间隔厚度较野生型无明显差异.结果表明,Tbx18参与小鼠心脏血管平滑肌及室间隔结构的形成,但其在小鼠心脏腔室结构及冠状血管结构形成过程中不是必需的.     

前列腺特异启动子和部分靶基因在转基因模型中的应用进展

遗传工程小鼠模型已被大量用于前列腺癌发生、发展、恶化和转移的研究。构建小鼠模型的途径主要包括转基因的过表达、基因敲除或敲入,以及使用Cre/lox技术进行条件调控。本文综述了目前构建的有明显遗传表型的转基因小鼠模型所用到的前列腺特异的启动子,以及所用到的靶基因。     

GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步.条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异.通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础.     

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)敲除和人源化小鼠模型的建立

目的 建立细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)基因人源化小鼠模型,为靶向CTLA4的肿瘤治疗性抗体研发和筛选提供有效的小鼠模型.方法 利用CRISPR/Cas9技术,建立CTLA4基因人源化和敲除小鼠模型,利用PCR、RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学和流式细胞术的方法对其进行鉴定及分析.将小鼠...     

小鼠中的基因修饰——2007年度诺贝尔生理或医学奖介绍

2007年的诺贝尔生理或医学奖授予了Mario R．Capecchi、Martin J．Evans和Oliver Smithies三位科学家,以表彰他们在使用胚胎干细胞对小鼠的特定基因进行改造中的杰出贡献。他们的工作,使人们可以在哺乳动物的生殖细胞中进行特定的基因改造,并繁殖出成功表达这种基因的后代。他们发明的这项遗传实验技术,也就是现在常说的“基因敲除”技术,     

SHBG基因敲除小鼠模型的建立及其表型分析

目的:建立性激素结合球蛋白(SHBG)基因条件敲除小鼠模型,为探讨胎盘组织中SHBG在体内的生理功能及其与妊娠期糖尿病发病关系提供实验手段。方法:首先运用生物信息学手段确定小鼠SHBG基因组序列,构建SHBG打靶载体,以电穿孔方法将其导入小鼠ES细胞,筛选培养阳性ES细胞并行PCR鉴定,并将正确同源重组的ES细胞注射进小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫;将获得的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配,筛选后获得Flox小鼠,该小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠杂交,子代多次自交获得SHBG全身基因敲除(SHBG~(-/-))的小鼠。结果:运用同源重组及ES细胞技术建立了SHBG基因的Flox小鼠,并利用Cre/Loxp重组酶系统建立了SHBG基因全身敲除小鼠模型,PCR方法从基因水平证明了SHBG基因Flox小鼠及SHBG基因全身敲除小鼠模型建立成功。对基因敲除鼠进行初步表型分析发现:SHBG基因全身敲除小鼠的生长发育与野生型小鼠相比无明显肉眼所见异常,SHBG基因全身敲除雌雄小鼠均具有生殖能力。结论:成功建立SHBG基因全身敲除小鼠模型,通过对基因敲除鼠进行初步表型分析,发现SHBG基因全身敲除小鼠外观上发育正常,为进一步研究SHBG在妊娠期糖尿病中的作用奠定了基础。     

小鼠肝癌模型研究进展

肝癌至今仍是全球高死亡率癌症之一。动物模型特别是小鼠模型是研究肝癌生物学特性、发病机制、新药筛选和治疗的重要工具。近年来,各种小鼠肝癌模型的发展在一定程度上促进了肝癌的相关研究,但是现有模型都有一定不足。缺乏与人类肝癌高度相似且经济适用的动物模型严重制约着对肝癌的深入研究。随着基因修饰技术的发展,小鼠肝癌模型的构建更加快速、容易和方便。本文拟对用于肝癌研究的各种小鼠模型进行概述,并着重强调基因修饰小鼠肝癌模型的构建,以期为相关癌症基因功能研究、应用基因编辑技术研发肝癌模型提供新思路和方向。     

基因修饰小鼠在脂代谢紊乱与动脉粥样硬化研究中的新进展

近十余年来,载脂蛋白(ApoE)与低密度脂蛋白(LDL)受体 (LDLr)基因敲除小鼠已成为研究脂代谢和动脉粥样硬化最为常用的模型.在这两种小鼠模型基础上,通过与不同的转基因、基因敲除小鼠杂交,产生了多种脂代谢紊乱和动脉粥样硬化小鼠模型,为发现调控血浆脂蛋白以及动脉粥样硬化发生的机制,创造了有利条件.此外,新的严重高甘油三酯血症小鼠模型也制备成功,本文笔者研究组研究了其中的脂蛋白脂酶缺陷模型与代谢性疾病的关系,得到了许多有意义的结果.而利用不同转基因和去基因小鼠作为供体, 以及ApoE或LDL受体缺陷小鼠作为接受体的骨髓移植技术,则大大丰富了人们对于巨噬细胞中不同基因在动脉粥样硬化发生、发展和消退过程中作用的认识.动脉粥样硬化的易损斑块形成是近年来的一个研究热点,应用小鼠模型进行模拟也取得了一定的成功.然而,小鼠与人类在脂代谢和动脉粥样硬化中存在很大的种系差异,本文对此也予以评述.     

SND1转基因小鼠的构建

目的:构建 SND1 过表达的转基因小鼠模型。方法:利用对小鼠 SND1 基因转录本构建 SND1 过表达载体pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1,利用受精卵原核注射技术,将外源线性pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1转基因载体注射到受精卵细胞核内,将存活受精卵进行胚胎移植制备 SND1 转基因小鼠,用PCR、RT-PCR技术鉴定转基因小鼠是否构建成功。结果:成功构建过表达 SND1 基因的转基因小鼠模型,为进一步研究 SND1 基因在动物体内的生物学功能奠定基础。     

可长期培养的“人造精子”——记小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞的建立

对于具有两倍体基因组的高等生物来说,想要进行某个基因功能的研究并非易事,需要对两个等位基因同时进行相同的操作。因此,如何在这些生物中,能像单倍体酵母那样易于开展基因筛选和改造工作,是众多科学家关心的问题。最近,Anton Wutz和JosefM.Penniger两个实验室相继获得小鼠单倍体胚胎干细胞,并证明其能很好的应用于正反向遗传筛选。但是,这些细胞是否能够将基因研究工作从细胞水平上升至动物水平,依然未知。基于此,李劲松和徐国良两个实验室通力合作,获得了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞AG-haESC,并称其为"人造精子"。因为这种"人造精子"不仅维持了较好的雄性印迹,能够如同精子一样注入卵母细胞后将遗传性状传递给后代;并且在体外能够长期培养扩增,可应用于基因的改造工作。孤雄单倍体胚胎干细胞的成功建立,为今后更有效、更快捷地获得基因改造动物提供了新的思路。     

动脉粥样硬化小鼠模型应用进展

动脉粥样硬化(arteriosclerosis, AS)是常见的心脏病和中风等心脑血管疾病的病理基础，其诱因具有复杂、多样的特点。小鼠模型凭借成熟的基因改造优势，为研究AS发病机制和药物疗效验证等方面提供了重要依据。本文基于脂蛋白代谢及组织病理学变化情况，综述了传统转基因与新型小鼠模型的病理特点及其在药物开发中的临床前应用潜力和局限性，以便今后该疾病相关机制研究可以有针对性地选择模型。     

唐氏综合征小鼠模型的遗传背景和应用

唐氏综合征(Down syndrome, DS)是最常见的常染色体异常疾病,由人类21号染色体(human chromosome 21, Hsa21)的重复引起。由于Hsa21的直系同源基因分散于小鼠16、17和10号染色体上,所以用小鼠模拟人类唐氏综合征并不容易。早期的Ts65Dn小鼠虽然具有DS表型特征,但其重复片段由电离辐射产生,未包含所有Hsa21直系同源基因。2004年,Cre/LoxP重组酶系统介导的染色体编辑技术在Ts1Rhr小鼠中的成功应用,解决了特定片段重复化的难题,使DS小鼠模型在基因重复和表型模拟方面实现了精准化。本文从同源基因重复和DS表型模拟两方面简要介绍了不同时期DS小鼠模型的优势和局限,为科研人员在DS研究中对不同小鼠模型的选用提供了参考。     

胸腺上皮细胞特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型的鉴定及免疫学特征观察

目的 构建并鉴定胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells, TECs)特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型,评价其免疫学特征。方法 采用小鼠胚胎干细胞(ES细胞,embryonic stem cells)打靶基因敲除技术,得到F0代的GSK-3β^flox/flox(GSK-3β^f/f)小鼠;再采用Cre-LoxP系统进行小鼠的繁殖;PCR鉴定,筛选出基因型为GSK-3β^f/fFoxN1-Cre^+/-(GSK-3β^-/-)小鼠,即为在TECs特异性敲除GSK-3β基因的小鼠。观察基因敲除鼠的一般生物学特征、繁殖能力和子代存活率。应用HE染色、流式细胞术及免疫荧光技术,比较基因敲除鼠和野生型小鼠免疫器官结构、胸腺、脾及外周血中免疫细胞比例及增殖能力差异。结果 成功构建TECs特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型。与野生型(wild type, WT)小鼠相比,GSK-3β^-/-小鼠一般生物学特征无明显差异,子代存活率> 90%;衰老进程中...     

金黄仓鼠在临床医学中的研究进展

动物模型是临床医学和新药研究的重要支撑条件。尽管小鼠模型应用广泛,但近年来的研究显示,小鼠并不能完全模拟人类疾病,亟需新的动物模型弥补小鼠在各类研究中的不足。相比于小鼠,金黄仓鼠(golden hamster, Syrian hamster),在生殖、肿瘤、病毒学、脂代谢及心血管疾病等研究领域均显示,其基因表达与人具有较高的相似性。随着基因编辑技术的进步,金黄仓鼠在临床研究中的应用得以进一步拓展。该综述重点探讨基因编辑金黄仓鼠在生殖医学、脂代谢及心血管疾病、传染病、肿瘤等研究领域的最新进展,阐明基因编辑金黄仓鼠模型在医学研究的应用,以助于更好地理解基因在人类健康和疾病中的作用。