栝楼ISSR-PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系:20 μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50 ng,引物的浓度为0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为0.8 U,dNTPs的浓度为200 μmol/L.随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条.经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析.     

黑籽南瓜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

以云南个旧黑籽南瓜叶片基因组DNA为模板,固定反应程序,采用L_(16)(4~5)正交试验设计的方法,对影响ISSR-PCR反应的五因素(dNTPs,Mg~(2+),引物,Taq DNA聚合酶,模板DNA)在四个水平上进行优化试验。研究建立起了适于云南黑籽南瓜ISSR-PCR的最佳反应体系:25μl反应体系中含10×buffer 2.5μl、0.15mmol/L dNTPs、2.5mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、1.5U Taq DNA聚合酶、DNA模板15ng。扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,进行35个循环,最后72℃延伸7min。该优化体系的建立为今后用ISSR标记技术进行黑籽南瓜种质资源的分类鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

锁阳ISSR-PCR反应体系的优化研究

通过单因素试验、正交试验的方法,对影响锁阳ISSR-PCR反应体系的7种主要因素在3个水平上进行优化筛选,得到锁阳ISSR-PCR反应的最佳体系:25μL反应体系中含有0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L Mg2+、10μmol/L引物、50 ng模板DNA、2.0 UTaq酶、1%去离子甲酰胺和2.5μg/μL牛血清白蛋白。相应引物的最佳退火温度为48.9℃。这一体系的建立为今后利用ISSR-PCR标记技术研究锁阳的遗传多样性奠定了基础。同时对ISSR-PCR体系中添加剂的作用进行了探讨,为添加剂在其他植物ISSR-PCR反应中的应用提供借鉴。     

正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应体系

该文利用正交试验设计的方法,对落叶松ISSR-PCR反应的5因素4水平进行试验,试验结果运用MINITAB软件进行分析,建立了落叶松ISSR-PCR反应的最佳体系,即在20μl反应体系中,模板50-200 ng,0.5μmol/L的引物,1×反应缓冲液,dNTP为0.15mmol/L-0.2mmol/L,1U的TaqDNA聚合酶,Mg2 2.0mmol/L-2.5 mmol/L。并进一步进行梯度退火试验,找到了最适的落叶松ISSR退火温度为56.4℃。     

四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系中的4种主要因素(Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,PCR结果用统计软件SPSS16.0分析。结果显示,Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP这3因素的不同水平对PCR反应结果都有显著影响,其中Mg2+的浓度影响最大。筛选出各反应因素的最佳水平,建立四数獐牙菜ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为3.0 mmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,0.6μmol/L引物,1UTaqDNA聚合酶,40 ngDNA,2.5μL10×buffer。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行四数獐牙菜遗传多样性分析以及物种保护奠定了技术基础。     

利用正交设计优化小苍兰ISSR-PCR反应体系

通过L₁₆(4⁵)正交试验,研究了镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响,建立了适合于小苍兰ISSR-PCR的反应体系。优化体系为：25 μL PCR反应体系中含有1×Taq酶缓冲液(10 mmol·L^-1 KCl,8 mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄,10 mmol·L^-1 Tris·HCl,pH 9.0,0.05% NP-40),2 mmol·L^-1 MgCl₂,0.06 U·μL^-1 Taq酶,0.4 μmol·L^-1引物,4.0 ng·μL^-1模板DNA,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.6 mmol·L^-1。利用温度梯度PCR,确定了最适宜的退火温度为51.5℃。该优化体系的建立为下一步对小苍兰进行ISSR分子标记奠定了基础。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

正交设计优化金发藓科植物ISSR-PCR反应体系

目的:建立金发藓科植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:利用正交设计的方法,对金发藓科植物(Polytrichaceae)IS-SR-PCR反应的5因素(Mg2 ,dNTP,primer,DNA template,Taq DNA polymerase)4水平进行试验。结果:在20μl反应体系中,模板DNA50ng,1.6μmol/L的引物,1×反应缓冲液,3.2mmol/L的Mg2 ,dNTP为1.2mmol/L,2U的TaqDNA聚合酶,反应程序为94℃预变性6min;94℃变性45s,57℃退火45s,72℃延伸2min,循环40次;72℃延伸10min。利用此结论,对20种金发藓科植物进行ISSR-PCR扩增,扩增产物的多态性为69.52%。利用引物841构建的指纹图谱,可区分20种金发藓科植物中的18种,分辨率达90%。金发藓科植物ISSR-PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR标记技术开展金发藓科植物种间遗传多样性分析提供一个标准化程序。     

黑木耳ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验设计的方法,对黑木耳ISSR-PCR(简单重复序列区间-多聚酶链反应)反应体系中的5种主要因素(Taq聚合酶,Mg2+,模板DNA,dNTP及引物)4个水平进行优化筛选,确立了适合黑木耳ISSR分析的优化反应体系(20μL),通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。     

雌雄栝楼的组织培养研究

对雌雄栝楼（Trlctmsanthes kirilowii Maxim）分别进行组织培养的研究结果表明：在雌雄栝楼组织培养过程中,愈伤组织的诱导和分化适宜的培养基均存在性别差异。愈伤组织诱导的适宜培养基分别是,雌性栝楼培养基为MS＋NAA0．5mg／L＋IBA0．5mg／L＋6-BA1．5mg／L;雄性栝楼培养基为MS＋NAA0．1mg/L＋IBA0．5mg／L＋6-BA0．5mg／L和MS＋NAA0．1mg／L＋IBA1．0mg／L＋6-BA1．0mg/L。愈伤组织分化的适宜培养基分别是,雌性栝楼培养基为MS＋NAA0．1mg／L＋IBA0．4mg／L＋6-BA1．2mg／L;雄性栝楼培养基为MS＋NAA0．3ms／L＋IBA0．2mg／L＋6-BA0．8mg／L;雌雄栝楼无根苗生根的适宜培养基均为MS＋NAA0．1mg／L。     

栝楼的组织培养与快速繁殖

栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim．）,也称瓜楼、药瓜、吊瓜等,为葫芦科栝楼属（Trichosanthes L．）多年生攀援植物。栝楼根、茎、叶、瓜皮及种子均具有一定的药用价值,其籽是炒货中的佳品。由于栝楼野生资源有限且遭严重破坏,尽管各地有少量引种栽培,但其产量却远不能满足市场需求,因此,对栝楼进行组织培养与快速繁殖具有重要意义。目前,仅有以栝楼腋芽为材料进行组织培养的研究报道。作者以栝楼的茎尖、茎切段和幼叶为外植体进行组织培养,通过对不同培养基的筛选和优化,初步建立了栝楼组织培养的快速繁殖体系,并获得了大量优良品种的无菌苗,为扩大生产提供了保障。     

根癌农杆菌转化桥楼及植株再生

用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株C58感染栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）无菌苗诱导冠瘿瘤,获得其冠瘿组织;栝楼冠瘿组织经除菌后能在无激素的MS培养基上良好生长,纸电泳检测结果表明其合成了冠瘿碱,表明Ti质粒转化成功,栝楼冠瘿组织在MS培养基上形成完整植株,移栽后良好生长。     

Production of Trichosanthin from the Hairy Roots of Trichosanthes kirilowii Maxim.

Hairy roots of Trichosanthes kirilowii Maxim. were successfully induced by infection with Agrobacterium rhizogenes strain R1601 and an in vitro culture system of thehairy roots was established. The presence of trichosanthin in the hairy roots of T. kirilowii was confirmed by western blotting. The yield of trichosanthin was determined to be 8. 16 mg/g fr. wt with SDS-PAGE gel electrophoresis and thin layer chromatography.     

瓜蒌种子休眠原因与破除休眠研究

瓜蒌果汁中含有抑制物质,可以引起部分种子休眠;清水冲洗12 h、浓硫酸处理10 min均可以破除部分瓜蒌种子休眠。     

栝楼雌雄植株的光合作用和蒸腾作用特性

对栝楼雌雄植株生长发育关键时期的光合作用和蒸腾作用进行研究.结果表明:在营养生长阶段,栝楼雄株的光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用效率均大于雌株;雄株比雌株提前22 d进入生殖生长阶段,当雄株进入生殖生长阶段后,其光合速率、蒸腾速率和气孔导度均大于雌株,但水分利用效率略小于雌株;当雌株进入生殖生长阶段后,其蒸腾速率和气孔导度大于雄株,而光合速率和水分利用效率显著小于雄株.气候因子对栝楼生长发育的影响主要是在营养生长和生殖生长初期,栝楼生长发育后期对气候因子的响应程度减弱.较高的温度和较低的湿度有利干栝楼的生长发育,光照可提高栝楼尤其是雄株的光合速率.进入生殖生长后,雄株的光合速率随光照的增强显著增加,而雌株的光合速率增加不显著;随气温的升高,雄株的蒸腾速率显著提高,雌株的光合速率极显著提高.     

镉与锌复合污染对栝楼幼苗生理特性的影响

通过室内盆栽实验,研究镉(Cd)、锌(Zn)复合污染对栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.)幼苗生理特性的影响.结果显示,随着Cd、Zn浓度的升高,叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、可溶性糖及紫外吸收物含量下降;超氧化物歧化酶(SOD)活性先升高再下降,过氧化物酶(POD)活性及类胡萝卜素含量呈升—降—升趋势;丙二醛(MDA)和可溶性蛋白含量分别呈S"型及倒N"型曲线变化.与对照相比,在不同浓度复合污染条件下,光合色素、可溶性糖、可溶性蛋白、紫外吸收物含量及SOD活性均有所下降,POD活性和MDA含量上升.研究表明,栝楼幼苗对Cd、Zn胁迫具有一定的耐受力,但高浓度Cd、Zn对幼苗正常生长有较为显著的抑制作用.     

根癌农杆菌对栝楼的遗传转化

用根癌农杆菌侵染栝楼（Ｔichosanthes kirilowii Maxim.)无菌苗后,获得冠瘿组织;栝楼冠瘿组织经除菌后能在无激素的ＭＳ培养基上良好生长,并合成冠瘿碱、表明Ｔi质粒转化成功,栝楼冠瘿组织中最高蛋白含量为１３０．６mg/g（鲜重）。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测其含有的蛋白种类与栝楼根含有的基本一样,研究表明,利用栝楼冠瘿组织作为培养系统生产天花粉粉蛋白有很好的开发前景。     

栝楼不同性别花芽分化形态解剖特征观察

采用体视显微镜、石蜡切片和树脂切片技术对栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.)不同性别花芽分化发育时期的外部形态和内部解剖结构进行了观察。结果显示,栝楼花为雌雄异株,仅有雌花、雄花两种性别分化,且雄花的发育速度明显快于雌花的发育速度。栝楼雌雄花芽长0.2 mm左右已完成性别分化;栝楼雄花为单性花,分化过程可分为6个时期,整个发育过程仅见雄蕊原基的分化及生长。栝楼雌花为"两性花",分化过程可分为7个时期,存在雌蕊和雄蕊共同发育阶段,后期雄蕊发育败退。本研究明确了不同性别栝楼花芽发育发生的各个阶段、形态变化特点、外部形态变化特征以及雌雄花芽的分化差异,建立了雌雄花芽内部结构分化与外部形态之间相关性,为栝楼早期幼苗鉴定及性别分化研究提供了一定的参考。     

天花粉凝集素的荧光光谱研究

天花粉凝集素在天然状态下荧光发射峰位于３３２ｎｍ处,以丙烯酰胺,ＫＩ及ＣｓＣ１等淬灭剂研究ＴＫＬ分子中Ｔｒｐ残基的微环境,发现只有丙烯酰胺能淬灭ＴＫＬ分子Ｔｒｐ的荧光,同此推断大部分的Ｔｒｐ残基位于ＴＫＬ分子内部,其荧光不易为Ｉ＾－或Ｃｓ＾＋接近而淬灭。疏水探针ＴＮＳ能够检测到ＴＫＬ中疏水微区的存在,并且这一疏水微区亦不同于ＴＫＬ的半乳糖结合位点,ＴＫＬ中不存在金属离子的结合部位。