西瓜CMO基因序列分析及受乙烯诱导后表达特性分析

CMO基因作为植物体内甜菜碱合成过程中的关键性基因,对植物抗逆有重要作用。为研究西瓜中逆境信号对CMO基因的调控机理,本研究从西瓜基因组数据库选取CMO同源的基因序列,利用生物信息学分析工具对该基因序列进行分析。结果表明:ClCMO基因的转录起始位点位于起始密码子上游236 bp处,启动子区域包含多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件等;该基因编码的蛋白含有417个氨基酸,分子量为47 190.4 Da,理论等电点为6.01,而蛋白功能预测显示具有氧化还原酶活性;系统进化树显示西瓜在同源关系上与同科的黄瓜和甜瓜更近。此外,以二倍体西瓜悬浮细胞为材料,结合qRT-PCR技术,对乙烯诱导下ClCMO基因的表达特性进行研究,发现乙烯模拟逆境信号诱导后整体呈现出先上升再下降的趋势,诱导后2 h ClCMO基因的表达量达到最高。以上结果表明ClCMO基因可被乙烯信号调控并能迅速响应逆境胁迫,并推测其可受多种不同激素信号综合调控甜菜碱生物合成来抵御逆境。本研究不仅为利用乙烯提高西瓜抗逆性提供了理论支持,而且为以后植物中CMO基因的深入研究奠定了基础。     

大豆E3泛素连接酶基因GmAIRP1的同源克隆及在烟草中的功能鉴定

E3泛素连接酶在植物抵御高盐及干旱等非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究克隆获得大豆E3泛素连接酶基因GmAIRP1,该基因cDNA全长为642 bp,编码213个氨基酸。蛋白结构域分析表明,GmAIRP1具有典型的RING-finger结构域。系统进化树分析表明,GmAIRP1与蒺藜苜蓿MtAIRP1同源性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,GmAIRP1可被高盐、干旱和ABA诱导表达,并在胁迫1 h或3 h时表达量达到最大。抗逆表型分析表明,GmAIRP1转基因烟草在高盐和干旱胁迫21 d后,生长状态优于野生型,提高了植株对高盐和干旱胁迫的耐受性。生理指标测定结果显示,在高盐和干旱胁迫下,GmAIRP1转基因烟草的POD和CAT活性提高,整体高于对照,MDA含量始终低于对照。以上研究结果表明,Gm AIRP1能够通过激活抗氧化酶活性、提高渗透调节物质的积累来增强植物抵御高盐和干旱胁迫的能力,在植物响应高盐和干旱胁迫中发挥正调控作用。     

异源表达蒙古沙冬青AmDREB1F基因提高转基因拟南芥的耐逆性

脱水应答元件结合蛋白 (Dehydration-responsive element binding proteins,DREBs) 是一类重要的植物耐逆相关转录因子。蒙古沙冬青Ammopiptanthus mongolicus是中国西北荒漠区特有的强耐逆常绿阔叶灌木。为探明其AmDREB1F基因在耐受非生物逆境中的功能和作用机理,文中对该基因编码蛋白的亚细胞定位、表达模式和转基因拟南芥的耐逆性进行了分析。结果表明：AmDREB1F编码的蛋白质定位于细胞核内;在室内培养幼苗中,该基因在正常条件下不表达,在低温和干旱胁迫下有较明显表达,在高盐和高温胁迫下仅有微弱表达,而在脱落酸 (Abscisic acid,ABA) 处理下不表达;在野外生长植株的叶片中,其表达量在秋末、冬季和早春远高于其他季节,而不同器官相比,其在根和未成熟果荚中的表达量远高于其他器官;将AmDREB1F在拟南芥中组成型表达可提高多个受DREBs调控的胁迫响应基因的转录水平,增强转基因株系对干旱、高盐和低温以及氧化胁迫的耐性,同时导致其生长发育延滞,外施赤霉素3可消除生长延滞现象;将该基因进行胁迫诱导表达也可提高转基因拟南芥对上述非生物胁迫的耐受性,而不影响其生长发育。这些结果说明AmDREB1F可能通过ABA非依赖的信号途径在响应和耐受逆境胁迫中起正调节作用。     

柠条锦鸡儿CkLEA1基因克隆及表达分析

植物受到逆境胁迫后,大量逆境响应基因会被诱导表达,LEA蛋白编码基因就是与植物抗旱、抗冷等非生物胁迫密切相关的一类基因.从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一条LEA蛋白编码基因并进行了克隆.序列比对与系统进化分析显示该基因属于LEA3基因家族成员,命名为CkLEA1(GenBank登录号是KC309408).克隆得到该基因gDNA长469bp,包含两个外显子和一个内含子;cDNA长357bp,包含300bp的开放阅读框,推导编码99个氨基酸的蛋白质.利用荧光定量PCR技术对CkLEA1基因在各种逆境胁迫条件的表达情况进行初步研究表明,CkLEA1受干旱、ABA、冷、热、盐和碱等处理不同程度地诱导,推测其与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫的机制有关.     

银新杨中与DRE元件结合的转录因子的克隆及鉴定分析

DREB类转录因子特异地与DRE元件结合,在植物感受非生物逆境(干旱、高盐和低温)胁迫时,激活一系列逆境应答基因的表达。我们选用银新杨(Populus alba×P. alba var. pyramidalis)为材料,通过PCR和同源EST搜索的方法克隆得到了一个类DREB的基因,命名为PaDREB2。酵母单杂交实验表明,该基因编码的蛋白能特异地与DRE元件结合并激活下游报告基因的表达。用RT-PCR的方法研究了PaDREB2的表达模式,结果表明PaDREB2受低温、干旱和高盐的胁迫诱导。     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。     

玉米钼辅助因子硫酸化酶基因启动子的克隆与功能验证

为克服组成型启动子启动外源基因过量表达引起的诸多问题,同源克隆(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase)基因（ABA3）的启动子(ABA3s)序列,并用PlantCARE软件分析其非生物逆境应答元件, 实时定量PCR检测ABA3基因在非生物逆境诱导下的差异表达后。然后,用该启动子构建启动GUS（β-glucuronidase）基因的表达载体, 基因枪法转化玉米愈伤组织。经组织化学染色法检测其表达后, 在高渗、高盐、低温胁迫处理及ABA诱导下检测GUS酶荧光值与荧光素酶(内参)发光值的比值(GUS/LUC), 以此评价ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性。结果表明, ABA3基因在模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫及ABA、乙稀诱导下差异表达, 说明该基因的启动子(ABA3s)具有非生物逆境诱导活性。序列分析表明, ABA3s启动子全长777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA、Circadian等多种非生物逆境胁迫应答元件。用ABA3s启动GUS基因构建的表达载体转化的玉米愈伤组织, 响应干旱、低温、高温、高盐胁迫等多种非生物逆境胁迫, 及ABA和乙稀诱导, GUS检测呈阳性。在8%甘露醇高渗条件下, GUS/LUC比值比空白对照高6倍。上述结果表明, ABA3s启动子具有非生物逆境诱导特性, 经进一步验证其功能后, 可用于玉米抗逆转基因研究。     

茶树CsCIGR基因克隆及表达特性分析

该研究以茶树基因组数据库为基础,采用RT-PCR技术,从茶树‘龙井43’中克隆得到基因CsCIGR。序列分析显示,CsCIGR基因开放阅读框长度为1 677 bp,编码588个氨基酸。进化分析表明,CsCIGR属于GRAS家族的PAT1亚家族。多序列比对显示,茶树CsCIGR蛋白与其他植物的GRAS蛋白氨基酸序列具有很高的相似性。氨基酸理化性质分析显示,CsCIGR转录因子属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示,CsCIGR可能位于细胞核中。启动子预测分析发现,CsCIGR启动子区域包含胁迫响应元件(STRE)、干旱应答元件(MYC)、厌氧诱导元件(ARE)等多种与逆境响应相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析结果显示,CsCIGR基因在低温(4℃)、高温(38℃)、干旱(200 g·L~(-1) PEG)、高盐(200 mmol·L~(-1) NaCl)胁迫下均能诱导表达,且对高盐,低温和高温胁迫响应更为明显,推测CsCIGR基因在茶树响应逆境胁迫中发挥重要作用。该研究为茶树抗性育种筛选基因提供了重要理论依据。     

陆地棉GhCDPK1基因响应干旱胁迫的功能初探

钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)是一类重要的钙信号感受蛋白和响应蛋白,在植物干旱、低温、盐碱等非生物胁迫应答中起着重要的调控作用。为探讨陆地棉GhCDPK1基因在干旱胁迫下所起的作用,该研究利用实时荧光定量PCR技术分析了PEG模拟干旱胁迫下该基因的表达量,发现GhCDPK1基因受干旱胁迫诱导。通过构建植物表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK1,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,发现干旱胁迫下转基因植株保水能力明显高于野生型植株,叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白含量及POD、SOD活性也高于野生型植株,而丙二醛含量低于野生型植株。研究结果表明,GhCDPK1基因作为正向调控因子响应干旱胁迫诱导,过表达GhCDPK1基因可以使植株积累更多的渗透调节物质、增强抗氧化系统酶的活性和维持细胞膜的稳定性来提高植物抵御外界干旱胁迫的能力。     

松叶猪毛菜NADP-苹果酸酶基因家族及启动子克隆分析北大核心CSCD

NADP-苹果酸酶(NADP-ME)是C_(4)植物的关键光合酶,在生物和非生物胁迫中发挥了重要的作用。为了进一步研究该酶编码基因的功能,该研究以典型荒漠C_(3)-C_(4)中间型植物松叶猪毛菜为研究对象,在克隆得到NADP-ME家族基因序列的基础上,研究其表达部位及在非生物胁迫下的表达模式,并克隆其启动子序列分析响应非生物胁迫的元件差异。结果表明:(1)成功获得松叶猪毛菜3个NADP-MEs,命名为SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4,CDS序列长度分别为1755、1758和1941 bp。(2)SaNADP-ME1主要在根中表达,SaNADP-ME2和SaNADP-ME4主要在叶中表达;在ABA、NaCl、NAHCO_(3)和PEG_(6000)胁迫下松叶猪毛菜幼苗中3个NADP-MEs均可被诱导表达,且SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的响应表达模式相似。(3)成功克隆得到SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4启动子区域2351、1655和2887 bp。生物信息学分析发现它们都含有基本启动子元件以及响应外界刺激的元件。     

Isolation and Functional Validation of Salinity and Osmotic Stress Inducible Promoter from the Maize Type-II H+-Pyrophosphatase Gene by Deletion Analysis in Transgenic Tobacco Plants

Salinity and drought severely affect both plant growth and productivity, making the isolation and characterization of salinity- or drought-inducible promoters suitable for genetic improvement of crop resistance highly desirable. In this study, a 1468-bp sequence upstream of the translation initiation codon ATG of the promoter for ZmGAPP (maize Type-II H⁺-pyrophosphatase gene) was cloned. Nine 5´ deletion fragments (D1–D9) of different lengths of the ZmGAPP promoter were fused with the GUS reporter and translocated into tobacco. The deletion analysis showed that fragments D1–D8 responded well to NaCl and PEG stresses, whereas fragment D9 and CaMV 35S did not. The D8 segment (219 bp; -219 to -1 bp) exhibited the highest promoter activity of all tissues, with the exception of petals among the D1–D9 transgenic tobacco, which corresponds to about 10% and 25% of CaMV 35S under normal and NaCl or PEG stress conditions, respectively. As such, the D8 segment may confer strong gene expression in a salinity and osmotic stress inducible manner. A 71-bp segment (-219 to -148 bp) was considered as the key region regulating ZmGAPP response to NaCl or PEG stress, as transient transformation assays demonstrated that the 71-bp sequence was sufficient for the salinity or osmotic stress response. These results enhance our understanding of the molecular mechanisms regulating ZmGAPP expression, and that the D8 promoter would be an ideal candidate for moderating expression of drought and salinity response genes in transgenic plants.     

黄瓜CsPGIP基因的克隆及表达分析

以加工型黄瓜材料NW99为对象,利用RT-PCR技术克隆黄瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PGIP),并分析其基因编码序列、组织表达特异性和诱导表达模式。结果表明:(1)从黄瓜中克隆到一个PGIP基因,命名为CsPGIP;CsPGIP基因全长1 026bp,读码框987bp,无内含子,编码328个氨基酸残基,具有xxLxLxxNxLt/sGxIPxxLxxLxxL结构域,属于Pgip基因家族。(2)CsPGIP基因与甜瓜PGIP基因同源性最高,与十字花科Pgip基因同源性较高。(3)CsPGIP在黄瓜各个器官都表达,但表达水平具有组织特异性,在嫩叶中表达量最高,在茎中表达量最低;该基因表达明显受到水杨酸诱导,可能在抵御外界病原菌入侵过程中起重要作用。     

丛枝菌根真菌通过上调根系及自身水孔蛋白基因表达提高玉米抗旱性

在模拟干旱条件下, 研究了接种丛枝菌根(AM)真菌Glomus intraradices对玉米(Zea mays)根部13种质膜水孔蛋白基因表达的影响, 同时观测了AM真菌自身水孔蛋白基因的表达情况。结果表明, 干旱条件下, 除Zm PIP1;3、Zm PIP1;4、Zm PIP1;5和Zm PIP2;2之外的接种处理能显著提高根部其他8种质膜水孔蛋白基因的表达(Zm PIP2;7表达量未检测出), 并且AM真菌菌丝中水孔蛋白基因GintAQP1表达也显著增强。与此同时, 接种处理明显改善了植物水分状况, 提高了叶片水势。AM真菌增强宿主植物根部及自身的水孔蛋白基因的表达对于提高植物抗旱性具有潜在的重要贡献。     

小麦胁迫相关基因W1的克隆及表达模式分析

应用噬菌体原位杂交技术从干旱胁迫诱导的小麦cDNA文库中克隆到一个胁迫诱导的基因片段别。删全长cDNA为901bp,其中,编码区长498bp,编码166个氨基酸。Southern杂交表明,W1是一个低拷贝基因。RT—PCR结果表明,W1受干旱、低温的诱导,但不受高盐的诱导。氨基酸序列分析发现W1有一个USP保守区（pfam00582）。同源性分析发现W1与一个水稻胁迫诱导蛋白（NM_001061239）的同源性为83％,但该类蛋白的功能尚无报道。肼是小麦第1个被克隆的胁迫相关蛋白基因,该基因的克隆有助于阐明小麦的抗逆机制,并为今后培育抗逆性小麦品种提供候选基因。     

芒果APl同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个APl同源基因全长cDNA,分别命名为MAPl-1(GenBank accession No.FJ529206)和MAPl-2(GenBank accession No.FJ529207).MAPl-1编码247个氨基酸,开放阅读框长度为741 bp,蛋白质分子量为28.54kD,等电点为8.31;MAPl-2编码248个氨基酸,开放阅读框长度为744 bp,蛋白质分子量为28.78 kD,等电点为8.70.同源性分析表明,它们的核苷酸序列与其它木本植物APl同源基因的一致性为72%～81%.实验分析表明,MAPl-1和MAPl-2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域,第88至第178个为K盒结构域;两个基因均定位于细胞核,且功能位点分布存在着不同,推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异.蛋白二级结构预测显示,MAPl-1蛋白有12个a-螺旋,4个β折叠区,14个β-转角;而MAPl-2蛋白有11个a-螺旋,5个β折叠区,15个β-转角:其大多数氨基酸具有亲水性.本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段.     

辣椒ATP硫酸化酶基因（CaATPS1）的克隆与逆境表达

采用 RT-PCR和RACE方法,克隆了叶绿体ATP硫酸化酶基因的全长序列,命名为CaATPS1,GenBank 登录号为KX009745。该基因包含1个长为1 377 bp的完整开放阅读框,编码 458个氨基酸,预测分子量51.11 kD,等电点6.74。氨基酸同源性分析表明,该基因与 GenBank 中登录的茄科植物烟草、马铃薯及其它物种中的ATPS1氨基酸序列具有较高的同源性;进化树分析表明,辣椒CaATPS1与同为茄科属的烟草、马铃薯和胡麻属的芝麻处于同一进化分枝上,而与十字花科植物进化关系较远;荧光定量PCR分析显示,CaATPS1能被低温、干旱、高盐、机械损伤、过氧化氢、水杨酸、乙烯利以及DC3000侵染等各种胁迫和信号分子诱导。