调控蛋白CRP和FNR对青霉素G酰化酶基因表达的影响

青霉素G酰化酶的表达受多种因素的调控。利用crp和fnr基因缺陷型菌株研究了葡萄糖阻遏和氧调控的机制。结果表明：FNR对pac表达不起调控作用,CRP对pac基因表达有正调控作用．并且CRP的结合位点位于结构基因上游的DNA序列上。随后,测定结构基因上游调控区的DNA序列,发现可能的CRP蛋白结合位点的同源保守序列为TGTGA。     

生淀粉糖化酶催化位点氨基酸及酶合成调控的初步研究

通过对Rhizopus OR-1UVN菌种所产生淀粉糖化酶在不同底物不同缓冲溶液条件下酶最适pH的测定,推测出该生淀粉糖化酶活力中心催化位点氨基酸是天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。实验证明5～50mg/mL浓度葡萄糖对生淀粉糖化酶没有抑制作用。分别以浓度<5mg/mL葡萄糖和淀粉为碳源的培养基进行不同碳源发酵实验,发现以淀粉为碳源的培养基Ⅰ发酵15h开始产生淀粉糖化酶,以葡萄糖为碳源的培养基Ⅱ发酵35h开始产酶(葡萄糖浓度<8mg/mL),而且前者菌体较后者少,由此可知葡萄糖对产酶有阻遏作用。实验还发现解阻遏熟淀粉糖化酶的葡萄糖浓度(15mg/mL)比生淀粉糖化酶的要高。由于葡萄糖的阻遏作用不发生在翻译水平,而发生在转录水平上,而且生淀粉糖化酶(G1)与熟淀粉糖化酶(G2)来自同一条DNA链,可以推测存在mRNA的拼接。通过以生淀粉为碳源的比较实验,发现生淀粉对生淀粉糖化酶形成的诱导作用可能主要是通过mRNA拼接的调节来实现的。     

沙眼衣原体质粒调控基因的上游序列有广泛的ChxR结合位点

目的:利用凝胶阻滞实验分析沙眼衣原体质粒调控基因的上游DNA序列与ChxR 的相互作用;方法:利用表达载体p ET-21b在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达ChxR ,重组蛋白的N端有T7标签、C端有6×His标签,用TALON金属亲和介质纯化重组蛋白;PCR扩增沙眼衣原体质粒调控基因的上游区约150 bp,连接p CR2.1载体,重组载体经单酶切,制备3'端生物素标记探针;用引物延伸实验确定glgA的转录起始位点,并合成5条glgA上游区的30 bp重叠探针;用凝胶阻滞实验分析ChxR 与以上探针的相互作用。结果:4个质粒调控基因的上游均有多个ChxR 结合位点,特别是glgA上游区至少有6个结合位点;glgA上游的ChxR 结合位点多位于启动子和启动子下游区。结论:ChxR 可能参与质粒调控基因的转录;在glgA转录中,ChxR 可能起转录抑制子的作用。     

空间飞行水稻pi-hit-1基因启动子功能分析

pi-hit-1基因是本实验室通过空间诱变找到的一个水稻新基因。为了对pi-hit-1基因启动子结构和功能进行研究,首先使用植物启动子分析数据库(PlantProm DB-TSSP,TFSEARCH,PLACE及PlantCARE)对该基因转录调控区序列进行预测分析,结果显示该基因上游调控区存在多个顺式元件,主要集中在翻译起始位点前300bp的区域,转录起始位点位于翻译起始位点前100bp,在转录起始位点前132bp存在TATA box元件。凝胶电泳迁移率实验(EMSA)发现翻译起始位点上游约300bp存在转录因子特异结合位点,为该基因的核心启动子,这与预测结果一致。采用系统生物学的方法研究水稻新基因pi-hit-1启动子结构,发现了该基因的核心启动子元件,为研究空间环境如何影响基因的转录调控提供了重要依据。     

水解淀粉的酿酒酵母菌的构建

把黑曲霉糖化酶cDNA,酵母磷酸甘油激酶基因启动子区和终止区以及酵母Ty因子的δ序列构建成整合型的糖化酶表达分泌质粒pKG 1。该质粒转化酿酒酵母Y33得到整合型转化子。转化子分泌糖化酶活力在3.0μ/ml以上,在以5％可溶性淀粉为碳源的培养基中静止培养7d,淀粉利用率达86％,生成酒精的浓度与以5％葡萄糖为碳源时相等。     

人Daintain 基因5'调控区序列的生物信息学分析

目的：探讨人Daintain 基因5''调控区的序列特征。方法：利用在线软件BLAST、Neural Network Promoter Prediction、Promoter 2.0、Promoter SCAN、EMBOSS、CpG Island Searcher 和TF SEARCH预测人Daintain 基因启动子区域、CpG 岛分布和转录因子结 合位点。结果：人Daintain 基因5''调控区存在1 个CAAT盒。Daintain 基因可能存在6 个启动子位点,CpG岛可能位于216 bp 区 间( 23 ~ 238 bp)。评分85 分以上时,该序列存在251 个可能的转录因子结合位点;评分90 分以上时,该序列存在70 个可能的转 录因子结合位点;评分95 分以上时,该序列存在16个可能的转录因子结合位点;评分100 分以上时,该序列存在7 个可能的转 录因子结合位点;这些结合的转录因子基本是与免疫细胞增殖或性别发生有关。结论：人Daintain 基因5''调控区的生物信息学研 究表明其转录受甲基化和多种转录因子的调控,为研究Daintain 基因启动子的功能提供理论基础。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

基于sRNA的氧化葡萄糖酸杆菌基因调控的研究北大核心CSCD

在氧化葡萄糖酸杆菌中建立一种调控基因表达的工具。通过顺式/反式作用的非编码小RNA与核糖体结合位点(RBS)的相互作用,在翻译水平上对氧化葡萄糖酸杆菌中目标基因的表达进行调控。以绿色荧光蛋白作为报告基因,在所构建的顺式调控系统中,插入RBS上游的顺式阻遏序列,能够在转录后与RBS形成茎环结构,从而抑制报告基因的表达。这一茎环结构能够被与顺式阻遏序列具有更高亲和力的抗阻遏序列打开,从而重启报告基因的翻译;在所构建的反式调控系统中,由独立启动子控制转录的非编码小RNA与RBS互补形成双链,通过阻碍核糖体与mRNA的结合抑制报告基因的表达。在此基础上,设计并导入了一系列反式作用的小RNA,实现了对氧化葡萄糖酸杆菌中内源基因pstI表达的抑制。本研究提供了一种在氧化葡萄糖酸杆菌中不同于传统基因敲除的调控基因表达的方法。     

基于sRNA的氧化葡萄糖酸杆菌基因调控的研究

在氧化葡萄糖酸杆菌中建立一种调控基因表达的工具。通过顺式/反式作用的非编码小RNA与核糖体结合位点(RBS)的相互作用,在翻译水平上对氧化葡萄糖酸杆菌中目标基因的表达进行调控。以绿色荧光蛋白作为报告基因,在所构建的顺式调控系统中,插入RBS上游的顺式阻遏序列,能够在转录后与RBS形成茎环结构,从而抑制报告基因的表达。这一茎环结构能够被与顺式阻遏序列具有更高亲和力的抗阻遏序列打开,从而重启报告基因的翻译;在所构建的反式调控系统中,由独立启动子控制转录的非编码小RNA与RBS互补形成双链,通过阻碍核糖体与mRNA的结合抑制报告基因的表达。在此基础上,设计并导入了一系列反式作用的小RNA,实现了对氧化葡萄糖酸杆菌中内源基因pstI表达的抑制。本研究提供了一种在氧化葡萄糖酸杆菌中不同于传统基因敲除的调控基因表达的方法。     

贵阳腐霉Pr1基因上游调控序列的克隆及分析

目的:克隆贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶(Pr1)基因上游调控序列并进行分析,进一步了解Pr1基因的表达规律。方法:采用锅柄聚合酶链反应法(Panhandle PCR)扩增Pr1基因上游调控序列,并利用真核生物启动子分析软件对扩增序列进行启动子顺式作用元件预测分析。结果:获得864bp基因序列,分析表明,该序列包含2个TATA框,一个可能的转录起始区,并具备氮调控因子结合位点(相隔很近的GATA序列),碳调控因子结合位点(5’SYGGRG 3’)。这与Pr1的表达受碳/氮抑制的结果一致。结论:Panhandle PCR方法成功克隆贵阳腐霉Pr1基因上游调控序列,GenBank登录号为:JQ975036。     

黑曲霉糖化酶基因启动子功能鉴定

从糖化酶工业生产菌株Aspergillus nigerCICIM F0410基因组DNA中扩增糖化酶基因启动子(PglaA),并将该启动子替换质粒pRS303K上KmR基因启动子,构建成糖化酶基因启动子功能检测质粒pRS-PglaA-KmR。将pRS-PglaA-KmR转入E.coliJM109中,得到重组菌E.coli(pRS-PglaA-KmR)。通过对重组菌的氨基糖苷磷酸转移酶基因活性检测,表明PglaA在E.coli中具有驱动KmR基因表达的活性。采用不同诱导物进行培养发现,葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或玉米淀粉,可以不同程度增强PglaA的强度。     

Cloning,heterologous expression,and enzymatic characterization of a thermostable glucoamylase from Talaromyces emersonii

The gene encoding a thermostable glucoamylase from Talaromyces emersonii was cloned and, subsequently, heterologously expressed in Aspergillus niger. This glucoamylase gene encodes a 618 amino acid long protein with a calculated molecular weight of 62,827Da. T. emersonii glucoamylase fall into glucoside hydrolase family 15, showing approximately 60% sequence similarity to glucoamylase from A. niger. The expressed enzyme shows high specific activity towards maltose, isomaltose, and maltoheptaose, having 3-6-fold elevated k(cat) compared to A. niger glucoamylase. T. emersonii glucoamylase showed significantly improved thermostability with a half life of 48h at 65 degrees C in 30% (w/v) glucose, compared to 10h for glucoamylase from A. niger. The ability of the glucoamylase to hydrolyse amylopectin at 65 degrees C is improved compared to A. niger glucoamylase, giving a significant higher final glucose yield at elevated temperatures. The increased thermal stability is thus reflected in the industrial performance, allowing T. emersonii glucoamylase to operate at a temperature higher than the A. niger enzyme.