山东鹅观草SSR-PCR反应体系的优化和验证

山东鹅观草是一重要的小麦野生近缘种质资源,具有对黄矮病的高抗性和易于小麦杂交的高亲和性等优良性状.以CTAB法提取山东鹅观草叶片DNA为模板,进行反应PCR体系优化.选用20 μL的PCR 反应,对Mg2+浓度、dNTP浓度、引物、DNA模板和Taq酶5个因素设计5个水平进行体系优化和验证试验.先以1个SSR标记(Xgwm43-7B )对5个因素进行筛选.为了验证所选最优体系的稳定性,再选用9个SSR标记(Xgwm18-1B、Xgwm32-3A、Xgwm6-4B、Xgwm60-7A、Xgwm67-5B、Xgwm77-3B、Xgwm88-6B、Xgwm95-2A和Xgwm99-1A)进行验证性试验.单因素试验结果表明PCR反应最佳体系为:20 μL 反应体系,2μL的 10×PCR Buffer,2.875mmol/L 的Mg2+,200μmol/L 的dNTP,3 pmol的引物,45 ng的模板DNA,1.5 U的 Taq 聚合酶,双蒸水以补足20 μL反应体系.验证性试验结果表明该反应体系有一定通用性,但扩增效果及PCR产量有差异.     

油梨基因组DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

旨在建立稳定可靠的油梨(Persea americana Mill)叶片DNA的提取方法和SSR-PCR反应体系及筛选出稳定的油梨SSR多态性引物,为开展油梨种质SSR分子标记提供遗传研究的基础。以油梨叶片为试材,比较3种油梨叶片DNA提取方法 ;利用L16(45)正交实验设计对油梨SSR-PCR反应体系进行优化;利用优化的反应体系筛选引物;同时,选取5对多态性引物对45份油梨种质进行PCR扩增,进一步检测该优化体系的稳定性。结果表明,常规2×CTAB法、改良2×CTAB法和植物DNA提取试剂盒法等3种DNA提取方法中,改良2×CTAB法对油梨基因组DNA的提取效果最佳;获得最优反应体系为:20μL总反应体系中,含约40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg~(2+)、0.15 mmol/L d NTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5μmol/L引物;以此体系为基础进行引物筛选,从73对油梨SSR引物中筛选出了30对扩增条带清晰的多态性引物,说明该反应体系可用于油梨SSR标记的进一步研究;稳定性检测获得的谱带清晰,表明该优化反应体系是稳定可靠的。由此可见,改良的2×CTAB法可用于油梨叶片DNA的大量样本提取,优化后的SSR-PCR反应体系及筛选出的30对多态性引物可用于油梨SSR标记的进一步研究。     

甜樱桃品种SSR-PCR反应体系的优化

以甜樱桃品种那翁为试材,研究了樱桃SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异.结果表明:在PCR反应体系中,DNA最适浓度30～45 ng;Mg2+的最适浓度范围为1.5～3.0 mmol/L;dNTP最适浓度为0.2～0.3 mmol/L;引物的最适浓度为0.3～0.4 μmol/L;Taq聚合酶在20 μl反应体系中宜加入0.5 U.利用此反应体系,对24份樱桃代表资源进行了SSR反应,用6%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测,扩增产物在100～250 bp之间,不同品种间DNA谱带多态性丰富.琼脂糖电泳检测的DNA多态性不如聚丙稀酰胺凝胶丰富.     

基于PCR的SSR标记分离方法综述

SSR分子标记是目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。SSR标记具有物种特异性,要应用该方法需要提前开发相应物种的特异SSR标记,而获得微卫星标记的经典方法是通过构建基因组片段文库和特殊标记SSR探针杂交法获取,这些方法经济成本相对较高且耗时耗力。近年来,该领域的研究中积累了很多研究成果和技术改进,发展起来几种基于PCR简便易操作且节约成本的SSR标记分离方法,例如基于RAPD的微卫星分离方法、基于ISSR抑制PCR扩增法、序列标签微卫星分析法、选择性扩增微卫星分析法以及荧光ISSR-PCR分离微卫星和微卫星扩增文库法等。本文主要对这些方法逐一进行综述,旨在为各个物种SSR标记的开发提供参考。     

云南松SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适宜云南松SSR-PCR的反应体系和扩增程序,利用近缘种火炬松的引物,采用正交设计L16(45)对云南松SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了适于云南松的SSR反应体系.在10μL的反应体系中,模板DNA的用量为30.0 ng,Taq DNA聚合酶的用量为1.0 U,Mg2+的浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.4 mmol/L,引物的浓度为0.2 μmol/L.扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,48℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃延长10 min,4℃保存.最后利用1个居群对该体系进行稳定性验证,结果可用于云南松SSR标记的研究.     

三种人参属植物的EST-SSR信息分析及其在三七中的应用

为了解人参属植物EST中SSR分布特点及其在三七SSR标记中的应用,利用生物信息学方法,用primer 3软件对dbEST数据库中人参属植物人参、西洋参和三七的EST序列进行搜索,发现人参属植物EST-SSR出现频率为11.54%,平均每4.39 kb出现1个SSR.人参属植物单核苷酸重复基元占主导地位,其次为三核苷酸重复基元和二核苷酸重复基元,分别占总SSR的54.48%、17.31%和16.36%.人参属EST-SSR的优势类型为A/T和AT/TA,分别占54.73%和8.21%.根据人参属植物EST中的SSR设计48对引物,在合适的PCR扩增体系下,用5个三七样品的DNA为模板进行PCR扩增,引物有效扩增率85.42%,其中多态性引物占可扩增引物的70.73%.结果表明,利用人参属EST序列开发三七EST-SSR标记是可行的.     

光萼荷属植物SSR反应体系确立与指纹图谱构建

利用正交试验设计优化并确立光萼荷属（Aechmea）植物SSR反应体系,构建部分光萼荷属植物的SSR分子指纹图谱。结果表明：光萼荷属植物的最佳SSR反应体系为10 μL总体积包括1×PCR buffer、Mg²⁺ 2.0 mmol·L^-1、dNTPs 200 μmol·L^-1、引物2.5 μmol·L^-1、模板DNA 90 ng和Taq DNA聚合酶1.5 U。利用该体系和6对SSR引物对15份光萼荷属植物进行扩增反应和电泳检测,其中M1、M3、M4等3对SSR引物扩增图谱清晰、多态性较高,均能将该15份光萼荷属植物鉴别出来,初步建立了15份光萼荷属植物的SSR分子指纹图谱,进一步证明该SSR反应体系稳定可靠,可以有效用于光萼荷属植物种质资源鉴定。     

毛细管电泳四色荧光检测法分析茶树SSR标记

将毛细管电泳四色荧光栓测技术应用于茶树SSR标记分析.该方法采用三引物PCR扩增SSR位点,三引物即在5'端加有M13尾巴序列(5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3')的特异正向引物、特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13引物:为了运用四色荧光检测系统使通过一次毛细管电泳能同时检测3个以上的SSR位点,采用蓝、绿、黑3种不同颜色的荧光染料分别对3个M13引物进行标记. 应用该方法对42个茶树品种(系)的16个SSR位点进行遗传分析的结果表明:此法具有简便、可靠、低成本及高通量的优点;且随着所分析SSR位点数的增加,降低成本的效果更加显著.采用建立的方法,还筛选获得了11个多态性丰富的可应用于茶树遗传研究的SSR标记.     

TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定.在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测.结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点.建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统.     

高粱抗丝黑穗病基因SSR反应体系的优化

目的:以高粱丝黑穗病2381(抗病)、矮四(感病)为材料,以优化SSR反应体系为 目的.方法:采用CTAB法提取高粱基因组总DNA,用SSR分子标记技术对其进行多态性扩增, 通过对体系中不同的Taq酶浓度、模板浓度、dNTP浓度和引物浓度的梯度分析. 结果:建立 并优化了的SSR-PCR反应体系为20ìl反应体系:dNTP浓度为200ìmol/L、Taq酶浓度为1.5U 、 DNA浓度为100ng和引物浓度为0.4ìmol/L.达到了较理想的扩增效果.用该体系对94对SSR 引 物进行了筛选,其中47对引物扩增出了多态性谱带,其中Xtxp3和Xtxp13在抗感的品种间扩 增出了差异谱带.结论:应用优化的SSR反应体系可以对高粱丝黑穗病基因进行分析.     

Simple sequence repeat analyses of interspecific hybrids and MAALs of <Emphasis Type="Italic">Oryza </Emphasis><Emphasis Type="Italic">officinalis</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Oryza sativa</Emphasis>

Wild rice is a valuable resource for the genetic improvement of cultivated rice (Oryza sativa L., AA genome). Molecular markers are important tools for monitoring gene introgression from wild rice into cultivated rice. In this study, Simple sequence repeat (SSR) markers were used to analyze interspecific hybrids of O. sativa-O. officinalis (CC genome), the backcrossing progenies and the parent plants. Results showed that most of the SSR primers (335 out of 396, 84.6%) developed in cultivated rice successfully amplified products from DNA samples of wild rice O. officinalis. The polymorphism ratio of SSR bands between O. sativa and O. officinalis was as high as 93.9%, indicating differences between the two species with respect to SSRs. When the SSR markers were applied in the interspecific hybrids, only a portion of SSR primers amplified O. officinalis-specific bands in the F(1) hybrid (52.5%), BC(1) (52.5%), and MAALs (37.0%); a number of the bands disappeared. Of the 124 SSR loci that detected officinalis-specific bands in MAAL plants, 96 (77.4%) showed synteny between the A and C-genomes, and 20 (16.1%) showed duplication in the C-genome. Sequencing analysis revealed that indels, substitution and duplication contribute to the diversity of SSR loci between the genomes of O. sativa and O. officinalis.     

Simple Sequence Repeat Analysis of Genetic Diversity in Primary Core Collection of Peach （Prunus persica）

In this study, the genetic diversity of 51 cultivars in the primary core collection of peach （Prunus persica （L.） Batsch） was evaluated by using simple sequence repeats （SSRs）. The phylogenetic relationships and the evolutionary history among different cultivars were determined on the basis of SSR data. Twenty-two polymorphic SSR primer pairs were selected, and a total of 111 alleles were identified in the 51 cultivars, with an average of 5 alleles per locus. According to traditional Chinese classification of peach cultivars, the 51 cultivars in the peach primary core collection belong to six variety groups. The SSR analysis revealed that the levels of the genetic diversity within each variety group were ranked as Sweet peach 〉 Crisp peach 〉 Flat peach 〉 Nectarine 〉 Honey Peach 〉 Yellow fleshed peach. The genetic diversity among the Chinese cultivars was higher than that among the introduced cultivars. Cluster analysis by the unweighted pair group method with arithmetic averaging （UPGMA） placed the 51 cultivars into five linkage clusters. Cultivar members from the same variety group were distributed in different UPGMA clusters and some members from different variety groups were placed under the same cluster. Different variety groups could not be differentiated in accordance with SSR markers. The SSR analysis revealed rich genetic diversity in the peach primary core collection, representative of genetic resources of peach.     

利用SSR标记与毛细管电泳对甘蔗属进行的遗传分析

为探讨甘蔗属内不同种之间的遗传多样性,利用SSR标记与毛细管电泳技术,对来自甘蔗属3个不同种的12个材料19对引物进行检测,共检测到229个DNA多态性条带,19对引物扩增的DNA条带范围集中在100～260bp之间。12个甘蔗材料的Jaccard遗传相似度,最小0.09,最大0.65,平均为0.26。通过遗传相似性系数分析,UPGMA聚类图内12个甘蔗材料可分为两个群,三个割手密种材料分为一个亚群,甘蔗栽培品种与甘蔗热带种合为一个亚群。结果表明:热带种比割手密种具有和甘蔗栽培品种更亲近的遗传关系;SSR分子标记与毛细管技术结合,相比别的分子标记技术或电泳技术,具有更准确、简便、自动化等优点。     

Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.).

A total of 2414 new di-, tri- and tetra-nucleotide non-redundant SSR primer pairs, representing 2240 unique marker loci, have been developed and experimentally validated for rice (Oryza sativa L.). Duplicate primer pairs are reported for 7% (174) of the loci. The majority (92%) of primer pairs were developed in regions flanking perfect repeats > or = 24 bp in length. Using electronic PCR (e-PCR) to align primer pairs against 3284 publicly sequenced rice BAC and PAC clones (representing about 83% of the total rice genome), 65% of the SSR markers hit a BAC or PAC clone containing at least one genetically mapped marker and could be mapped by proxy. Additional information based on genetic mapping and "nearest marker" information provided the basis for locating a total of 1825 (81%) of the newly designed markers along rice chromosomes. Fifty-six SSR markers (2.8%) hit BAC clones on two or more different chromosomes and appeared to be multiple copy. The largest proportion of SSRs in this data set correspond to poly(GA) motifs (36%), followed by poly(AT) (15%) and poly(CCG) (8%) motifs. AT-rich microsatellites had the longest average repeat tracts, while GC-rich motifs were the shortest. In combination with the pool of 500 previously mapped SSR markers, this release makes available a total of 2740 experimentally confirmed SSR markers for rice, or approximately one SSR every 157 kb.     

李白盾蚧转录组分析及SSR位点开发

李白盾蚧Pseudaulacaspis prunicola (Maskell)寄主范围广泛,是一种重要的入侵害虫。本研究利用高通量测序平台（Illumina NovaSeq 6000）对李白盾蚧进行转录组测序、de novo从头组装及功能注释,在此基础上筛选其微卫星（SSR）位点,并挖掘微卫星引物。研究共获得李白盾蚧转录组60 296条转录本,24 967条单基因（unigenes）序列。通过GO数据库注释,将所有unigenes的功能分为生物学进程、细胞组分和分子功能三大类41个亚类功能区。KOG数据库注释结果显示,5 085条unigenes归到25个基因家族,注释到一般功能预测的数目最多。KEGG代谢通路富集分析显示6 668条unigenes注释到280个代谢通路,其中注释到内质网中蛋白质加工的数目最多。利用MISA软件共搜索到微卫星位点18 193个,分布在9 043条unigenes中,占总unigenes数量的36.22%,平均每2.29 kb出现一个SSR位点。其中主要重复类型为单核苷酸重复,占SSR位点总数的72.03%,其次为三核苷酸重复（15.90%）和二核苷酸重复（8.48%）。单核苷酸重复主要为A/T（71.16%）,二核苷酸重复主要为AG/CT（5.20%）。基于Primer Primer 3软件设计出12 538对李白盾蚧SSR引物,从中随机挑选50对引物进行PCR验证,共29对引物可以稳定扩增出目的片段。本研究成功组装了李白盾蚧转录组数据,并基于转录组数据成功筛选出其微卫星位点,为未来该虫的种群遗传学以及入侵生物学研究提供了数据支撑。     

Characterization and Genetic Mapping of Simple Sequence Repeats in the Rice Genome

We searched partial sequences of over 22,706 rice cDNA and 1220genomic DNA clones to find and characterize simple sequencerepeats (SSRs) in the rice genome. The most frequently foundrepeated SSR motif in both cDNA and genomic DNA sequences wasd(CCG/CGG)n. The second most frequently found SSR was d(AG/CT)n.In contrast with mammalian genomes, in which d(AC/GT)n sequencesare the most abundant, d(AC/GT)n sequences were not frequentlyobserved in rice. Sequences containing d(CCG/CGG)n, d(AG/CT)nrepeats, and other SSRs were chosen for polymorphism detection.It was predicted that 17 of 20 SSRs in cDNA sequences were locatedin 5'-untranslated regions near initiation codons. Twenty-twoloci can be mapped on our RFLP linkage map by these SSRs. Sixmarkers were tested with 16 japonica rice varieties as templatesfor PCR. Two markers exhibited amplified fragment length polymorphismamong these rice varieties, implying that SSRs are polymorphicamong rice varieties which have similar genetic backgrounds.Even these polymorphic SSRs are located within or around geneswhich code ubiquitous proteins.     

草莓DNA分子标记及其应用

综述了限制性长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)等不同类型分子标记在草莓指纹图谱构建、品种鉴别、遗传多样性、进化、遗传作图以及相关性状的标记等方面的应用,分析了草莓分子标记研究中的关键问题,提出了今后研究方向。     

小麦A/B染色体组SSR标记在新小麦合成前后的比较研究

微卫星分子标记已广泛用于普通小麦遗传和进化研究。由于人工合成小麦与小麦品种之间存在高的遗传多样性,人工合成小麦已被大量应用于小麦分子标记工作中。但是,目前还缺乏人工合成小麦的异源六倍化过程对微卫星影响的研究。本研究直接比较了四倍体小麦与节节麦远缘杂交并经染色体加倍获得人工合成小麦前后,位于普通小麦A/B染色体组不同染色体臂上的66个特异引物揭示的微卫星位点的保守性和可转移性。结果表明,除了一个引物在新合成小麦中扩增出供体亲本没有的新带,一个引物在节节麦扩增出的产物在新合成小麦中消失,其他的所有微卫星引物的扩增产物在小麦合成前后是保守的,没有变异发生。所有的引物能够在四倍体小麦中扩增出微卫星产物,四倍体小麦中的扩增产物也出现在新的人工合成小麦中;有70%的引物能够在节节麦扩增出产物,其中的绝大多数产物也出现在新的人工合成小麦中。因此,普通小麦A/B染色体组的这些微卫星引物除了在人工合成小麦的A/B染色体组中扩增出产物,还能在其D染色体组中扩增出产物,也就是说,这些引物对人工合成小麦而言,并非是A/B染色体组特异的。根据该研究结果,讨论了小麦微卫星的可转移性和特异性问题,重点讨论了在应用人工合成小麦构建的遗传群体进行微卫星分子标记中的应用价值及其应该注意的问题。     

甘蔗属不同种及优良甘蔗栽培品种的SSR标记遗传多样性分析

应用21对SSR引物与毛细管电泳技术,分析了52个甘蔗属品种的遗传多样性。共检测出327个SSR标记,平均每对引物检测15.6个。选择141个共显性标记构建SSR标记指纹图谱数据库,利用DNAMAN软件与UPGMA统计方法分析参试材料遗传多样性。DNAMAN软件同源分析显示,新台糖16号与台优1号之间的同源性最高(87%),品种之间最小的同源性为55%;利用UPGMA统计方法可把参试材料分成4个遗传相似性较高的类群。结果表明,SSR标记与毛细管技术的结合,可构建甘蔗种质资源SSR标记指纹图谱、分析甘蔗种质资源遗传多样性。聚类分析显示参试甘蔗材料的遗传基础相近,为了提高甘蔗选育种效率,应拓宽甘蔗选育种亲本的遗传基础,提高杂交栽培品种的抗虫、抗病等特性。