灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8（LZ-8）基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。     

风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达

目的:表达风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组融合蛋白.方法:经过双酶切鉴定和测序鉴定的阳,陛重组质粒载体pGEX-2T/E1-N,转化到感受态大肠杆菌BL21后,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,并对诱导条件进行优化.用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化重组融合蛋白,SDS-PAGE鉴定.结果:用IPTG可以诱导E1特异肽段的重组融合蛋白表达,37℃诱导时,最佳诱导剂浓度为1 mmol/L,最佳诱导时间为4h.诱导温度从37℃降至16℃时,重组融合蛋白以可溶性形式表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的重组融合蛋白.结论:利用原核表达系统可以获得纯化的风疹病毒E1特异肽段的重组融合蛋白.     

甜瓜黄瓜素基因启动子表达载体的构建及分析

该研究构建了由黄瓜素基因5′端310bp启动子序列驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的植物表达载体pPZP-CGN,通过花粉管通道法将植物表达载体pPZP-CGN导入甜瓜,并采用荧光法定量测定转基因植株中GUS活性。结果显示,gus基因在果实中高表达,而在根、茎、叶等组织中表达活性很低,表明黄瓜素基因上游310bp启动子具有指导外源基因在果实中高效特异表达的特性。     

风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2重组体的构建表达与抗原性分析

风疹病毒(Rubella virus, RV)是人类最重要、最常见的致畸病毒之一,但其致畸机理至今尚未完全明了[1].RV的包膜上镶嵌着两个糖蛋白E2和E1,E2/E1以异二聚体的形式在病毒体表面形成刺突结构[2].E2的糖基化程度很高,存在O-联及N-联糖基化位点,糖类在成熟的E2蛋白中所占比重大于三分之一,E2蛋白的糖基化程度影响蛋白功能,糖基化位点的改变可能与RV减毒有关[3].     

风疹病毒毒株的分离鉴定及其E1基因部分序列分析

利用逆转录巢式PCR技术检测61例风疹高发人群的血液标本,经细胞培养技术从RV RNA阳性标本中分离风疹病毒株,应用细胞病变、血凝试验、电镜观察及PCR扩增等实验证实其为风疹病毒,命名为HRB株.同时还对该分离株的E1基因部分片段进行序列分析并与其它型别基因进行比较,结果显示,此分离株与中国疫苗株(BRDⅡ)及另外2株香港分离株均不在同一分支,而是位于由20世纪60年代分离株所构成的一个亚支上.     

番茄E8基因启动子的克隆及其在拟南芥中的表达

利用PCR技术从番茄基因组DNA中克隆长约1.1kb的E8基因启动子与517bp的E8基因片段,将其二者连接构建植物表达载体,导入农杆菌,通过花序侵染法转化拟南芥,得到转基因拟南芥。用RT-PCR分析转基因拟南芥中E8基因启动子驱动E8基因小片段的结果表明,E8基因小片段mRNA仅在转基因拟南芥长角果中转录,根、茎、叶、花中不转录,提示E8基因的1.1kb启动子在异源植物拟南芥中仍具有驱动外源基因果实特异性表达的特性。     

棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到PEPC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子(1123bp)、α球蛋白B基因启动子(1149bp)连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。     

苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建

[目的]通过比较cry1A、cry3A、cry4A和cry8E四个基因的启动子转录活性,筛选出一个强启动子,利用强启动子构建一个苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)高效表达载体.[方法]利用启动子融合lacZ技术检测了4种启动子的转录活性.通过扫描电子显微镜观察晶体、SDS-PAGE、蛋白定量和生物活性测定等方法对新建高效表达载体进行功能验证.[结果]构建了Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E4个启动子融合报告基因lacZ的表达载体,经β-半乳糖苷酶活性分析得知,启动子活性从高到低依次为Pcry8E＞Pcry1A＞Pcry4A＞Pcry3A.选取cry8E启动子,以pHT315作为基础载体构建苏云金芽胞杆菌高效表达载体pHT315-8E21b,将cry1Ac基因连接到pHT315-8E21b和广泛应用的cry3A启动子指导的pSXY-422b上,分别转入无晶体突变株HD-73-,获得菌株HD-8E1Ac和HD-422-1Ac.扫描电子显微镜观察显示,HD-8E1Ac菌株可以形成菱形晶体,说明正确表达了cry1Ac基因.SDS-PAGE分析结合蛋白定量实验表明pHT315-8E21b表达效率高于pSXY-422b.对小菜蛾(Plutella xylostella)的生物活性测定表明HD-8E1Ac菌株对小菜蛾有生物活性,且菌株活性高于HD-422-1Ac.[结论]利用强启动子Pcry8E构建了一个能在Bt中高效表达的穿梭载体pHT315-8E21b,该载体可正确表达cry1Ac基因,其表达效率高于被广泛应用的pSXY422b.     

果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量

根据GenBank中番茄的番茄红素β-环化酶(Lcy)基因序列和八氢番茄红素去饱和酶基因(Pds)启动子序列设计特异引物从番茄基因组DNA中分别扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理,将Lcy基因的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段,将该片段与Pds启动子一起插入到pVCT2020的表达载体中,通过农杆菌介导的方法转化番茄,获得转基因植株5棵,PCR检测证实外源片段已成功导入番茄基因组中。收获转色期后20d左右的完全成熟的番茄果实提取番茄红素进行含量分析,结果显示转基因番茄果实中番茄红素的含量极大的增加了。上述结果表明通过RNAi果实特异性的抑制类胡萝卜素代谢途径中生物合成酶基因的表达能够极大的增加番茄果实中番茄红素的含量。这为通过基因工程手段提高番茄果实中的营养价值提供了参考。     

风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对其细胞融合活性的影响

为了探讨风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对风疹病毒细胞融合活性的影响,在构建重组载体pBSK-SPE2E1的基础上,利用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法,构建了11个突变体,分别将E1外功能区的11个半胱氨酸残基突变为其它氨基酸残基,从而去除一个二硫键,利用Giemsa染色法定性检测由此引起的细胞融合情况,流式细胞术检测导入的外源DNA在细胞表面的表达效率,血吸附检测重组表达的突变体蛋白的受体识别活性。结果表明E1外功能区的10个二硫键对RV的细胞融合活性都有重要影响,任何一个二硫键的去除均导致E1的细胞融合活性丧失;其中第5和第8个半胱氨酸残基所形成的二硫键与E2和E1的相互作用有关,第3、第4和第13个半胱氨酸残基所形成的二硫键可能直接影响E1的细胞融合功能。     

水稻草矮病毒NS6基因在大肠杆菌中的表达及植物表达载体的构建

Large amount of disease-specific protein(SP) accumulated in the rice plant cells infected by rice grassy stunt virus(RGSV). It was deduced that the protein was encoded by NS6 gene on genomic vRNA6 and thus referred to as NS6 protein.But its function is unknown. In an effort to prove the above deduction and to elucidate the function of NS6 protein of RGSV, we constructed a bacterial expression plasmid pGTNS6 producing a fusion protein of glutathione S-transferase (GST) and NS6 protein, and a plant expression vector pCBTNSv6 containing NS6 gene. A recombinant plasmid pTNSv 6 containing the coding region of NS6 gene and the non-coding region at its 5' terminus, cloned by RT-PCR from purified RNAs of Shaxian isolate of RGSV, was used as the start point. Western blot analysis showed that the fusion protein reacted strongly with antisera raised against RGSV-SP, which served as evidence of the deduction.EHA105 of Agrobacterium tumefasciens containing pCBTNSv6 has been obtained and the transformation of rice is underway.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

流感病毒ns1基因的克隆及其原核表达载体的构建

为了解H5N1亚型流感病毒株的ns1基因特性及其规模制备NS1蛋白,首先将病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增流感病毒全长ns基因.测序显示H5N1亚型流感病毒NS1 cDNA全长678bp,编码225个氨基酸.BLAST分析表明,Qa/ST/852/01(H5N1)病毒株ns1基因与近年来从华南地区分离的禽H5N1毒株的ns1基因有很高的同源性.之后采用PCR方法扩增ns1基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T-3载体中,与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因融合,构建重组质粒pGEX-4T-3/NS1 cDNA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析,GST-NS1融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,并且以可溶形式存在,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的28.5%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%以上.经免疫印记证实重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别.该表达载体的构建为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备提供了基础.     

番木瓜环斑病毒YsCP基因的序列分析和植物表达载体的构建

用双脱氧链终止法分析了克隆的番木瓜环斑病毒（PRV）Ys株系外壳蛋白（CP）基因的序列,结果表明YsCP基因全长858nt。对PRV国内外16个株系或分离物CP基因的比较发现,YsCP基因与国内株系或分离物CP基因的同源性较高（94．44％～97．68％）,而与国外株系或分离物CP基因的同源性较低（88．88％～92．70％）。CP基因之间的差异主要靠近基因5’端,特别是在YSCP基因第63nt后连续缺失6nt,SmGTHAI和SRI的CP基因也在此处缺失3nt。将YsCP基因插入中间质粒pRokⅡ的CaMV35S启动于和nos终止序列之间形成CP基因的植物表达载体pRPCY,通过三亲交配使pRPCY进入农杆菌LBA4404,与其中的pAL4404构成双元载体系统。