真核基因在pET系统中表达出现的问题与拟解决的方案

pET表达系统是以噬菌体的T1为启动子,可以从各种基因(包括原核、真核细胞)生产大量的目的蛋白,然而一些真核基因在pET表达系统中的蛋白表达量却很少,有许多因素影响真核基因在该表达系统中的表达,如信号肽序列、毒性基因与质粒的稳定性、mRNA转录的二级结构和稀有密码子,以及实际操作过程中表达条件等均会影响真核基因在pET系统中的表达。该文旨在分析其主要原因,并提出拟解决的方案,以达到满意的高效表达。     

外源基因在叶绿体表达系统中高效表达研究进展

综述叶绿体表达系统的特点,转化方法,同质化研究及提高外源基因在叶绿体基因组中表达水平的研究状况。     

杆状病毒表达系统研究进展

介绍了杆状病毒表达系统的构建策略,载体发展情况及其表达外源基因的影响因素.杆状病毒表达系统在基因工程、药物开发、疫苗生产等方面发挥了越来越重要的作用,其表达效率高,表达产物与天然产物有相似的结构和活性,且对人畜无害,为当今基因工程研究中最有发展前途的表达系统.     

重组人血清白蛋白表达研究进展

本文综述了重组人血清白蛋白在细菌,酵母,植物和动物等表达系统中表达的研究进展。用酵母表达系统,尤其是毕赤酵母,表达的重组白蛋白产量高且提取工艺简单,是其产业化最具有前途的表达系统。同时在转基因动物、植物中培养表达也具有诱人的前景。     

利用植物系统表达重组蛋白的的研究进展

植物是可以生产不同生物药剂品的成本低廉的生物反应器,综述了稳定转化系统、瞬时表达系统以及叶绿体基因组转化方法,这三种不同的植物表达系统的特点和研究现状,并对其存在的问题及未来的前景进行了分析。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制.因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达.我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837 bp的拖牵丝蛋白基因(ASP),并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN.pASG在大肠杆菌中16℃下24 h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48 h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达.本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试.     

利用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展

随着基因工程技术的迅速发展,已有数百种外源蛋白利用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了成功表达。本综述了该表达系统的优点、系统的构成,外源基因转化该表达系统的方式及表达特点,阐述了该系统在生产外源蛋白上的广泛应用．并重点分析了影响外源蛋白在该表达系统中表达的因素及优化策略等。     

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键.毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多种蛋白质.简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基础研究和最新进展.     

枯草杆菌表达系统的研究进展

枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性的良好的发酵基础,是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。本阐述枯草杆菌基因表达的一般特点、表达载体、表达类型以及分泌表达存在的问题。     

Introduction and Expression of Recombinant Genes in Ascidian Embryos

In order to examine the expression of exogenous genes introduced into ascidian eggs, two recombinant plasmids pmiwZ and pHrMA4aCAT were microinjected into the cytoplasm of fertilized eggs of Ciona savignyi and Halocynthia roretzi , respectively. The plasmid pmiwZ contains the coding sequence of bacterial β-galactosidase gene ( lac-Z ) fused with animal gene promoters, while pHrMA4aCAT was constructed by fusing about 1.4-kb long 5' flanking region of H. roretzi muscle actin gene HrMA4a with bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene ( CAT ). Injection of approximately 160 pl of 10 μg/ml pmiwZ DNA into Ciona eggs did not affect the embryogenesis, although introduction of the same volume of 30 μg/ml pmiwZ DNA resulted in abnormal development of injected eggs. When the expression of lac-Z was examined by histochemical detection of the enzyme activity, the expression was evident in the early tailbud embryos and later stage embryos, and larvae, irrespective of linear or circular form of the plasmid. The enzyme activity appeared in various cell-types including epidermis, nervous system, endoderm, mesenchyme, notochord, and muscle. In contrast, when pHrMA4aCAT was introduced into Halocynthia eggs and the appearance of CAT protein was examined later by the anti-CAT antibody, the CAT expression was restricted to muscle cells. These results indicate that the recombinant genes introduced into ascidian eggs could express during embryogenesis and that the 1.4-kb long 5' flanking region of HrMA4a contains regulatory sequences enough for the appropriate spatial and temporal expression of the gene.     

食品级乳酸菌表达系统研究进展

乳酸菌表达系统是近几年发展起来的食品级高效表达系统。乳酸菌具有益生菌特征,因此该表达系统与其他细菌表达系统相比有很多优点。介绍了糖诱导表达系统、噬菌体Φ31爆发式诱导的表达系统、乳链球菌素调控表达系统、温控表达系统等的研究进展,以及这些系统的应用前景。     

牙鲆钙调素基因在原核和真核细胞中的表达

设计特异引物,以SMART cDNA为模板,应用PCR方法扩增牙鲆钙调素基因（Paralichthys olivocew calmodulin,PoCaM）。计算机辅助分析表明,PoCaM基因编码149个氨基酸的推定蛋白,其分子量为17kD,等电点为3．93,含有4个螺旋-环-螺旋样结构,与其它鱼类CaM氨基酸一致性为97．3％-100％。构建原核表达重组质粒pET32a／PoCaM,转化大肠杆菌B121（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS—PAGE蛋白电泳,结果显示PoCaM在大肠杆菌中进行了特异性融合表达,融合蛋白分子量约为34kD,与预期分子量大小一致。同时,以绿色荧光蛋白（GFP）为表达标签,构建真核表达重组质粒pEGFP—N3／PoCaM,经Lipofectamine 2000介导转染鲤鱼上皮瘤细胞（ Epithelioma papulosum cyprinid, EPC）,荧光显微镜观察显示,PoCaM在EPC细胞中进行瞬时表达,主要分布于细胞核及胞浆中[动物学报54（6）：1061—1067,2008]。     

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究

采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V<,1>变异型全长序列和V<,2>变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段.并克隆入pET30a<'(+)>载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%.表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白.将融合蛋白免疫小...     

转基因植物表达重组蛋白的研究进展

植物表达系统的一些潜在优点 ,如重组蛋白的高积累水平 ,糖基化 ,细胞内的定位和自然储藏的稳定性是目前植物生产重组蛋白系统研究成为热点的主要原因 .在研究和选择转基因植物表达系统的过程中 ,转化 ,转化后 ,翻译 ,翻译后等环节都会影响到最终产物的数量和质量 ,因此应该了解基因表达的规律 ,以制定植物生产重组蛋白合适的策略 ,重组蛋白积累水平是关键 ,但其它因素如植物的选择 ,转基因植物的处理 ,下游加工等同样重要 .某些情形下 ,仅下游加工的成本一项就影响到特定植物表达系统的实际应用价值 .     

用于药用蛋白生产的外源表达系统

种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存.而通过遗传改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能,不断建立更加优越的外源蛋白表达系统则是大家共同努力的目标.     

用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达新技术

近年来,用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞表达领域涌现出一系列革命性的新技术。优化的工程细胞为表达重组蛋白提供了优良的宿主;基于荧光的筛选方法可以快捷地得到高表达细胞株;高通量的培养工艺能够预测适合外源蛋白表达的细胞培养条件;可抛弃式生物反应器为大规模细胞培养提供了更多的选择;大规模瞬时表达技术节省了重组蛋白的生产时间。这些新技术提高了重组蛋白的研发和生产效率,加快了蛋白药物的工业化进程。     

无细胞系统的基因表达与蛋白质合成

无细胞翻译——利用细胞提取液在体外合成蛋白质,已是国外分子生物学实验室的一项常规技术,但在国内此项技术的利用却几乎是空白.对体外无细胞系统的特性、功能、优缺点及其进展等进行了全面的介绍,以期使国内学者了解和利用这一方便而有效的表达系统,进行应用生物化学与分子生物学的实验研究.     

丝状真菌蛋白表达系统研究进展*

丝状真菌以其优秀的表达分泌能力和良好的环境适应能力,使得其在蛋白质表达领域应用越来越广泛。近几十年来,通过诱变、培养优化及遗传改造等手段,使得包含曲霉属、木霉属、青霉属等在内的丝状真菌被开发成高效表达宿主。为促进丝状真菌蛋白表达系统的开发,结合作者的研究工作,对工业上丝状真菌表达宿主、蛋白质表达元件及其改造策略进行综述,并探讨了当前丝状真菌表达系统开发过程中的不足之处,为新型丝状真菌表达系统的研究提供参考和启示。     

重组蛋白在大肠杆菌周间腔的分泌表达

大肠杆菌是用于生产重组蛋白的重要工程宿主菌。但是,要获得足够的正确折叠的蛋白还存在一定的缺陷,其中一种解决此问题的方法就是使重组蛋白分泌到大肠杆菌的周间腔里。在这篇综述中,主要讨论了使重组蛋白分泌表达至大肠杆菌周间腔的近期的研究进展。