H22腹水型肝癌荷瘤小鼠耐受性的性别差异

目的:观察性别对小鼠H22腹水型肝癌生长情况的影响,研究不同性别动物对肝癌耐受性的差异。方法:取30只8周龄昆明鼠,雌雄各半,随机分为四组,实验组每组10只,对照组每组5只,腹腔接种小鼠H22肝癌细胞,建立小鼠H22腹水型肝癌模型。每天测量小鼠体重并记录生存时间,直至实验组小鼠全部死亡,比较性别因素对小鼠H22腹水型肝癌的生存期是否存在差异。结果:小鼠接种瘤细胞后,逐渐产生腹水,体重增加。雌性小鼠的体重增加比雄性小鼠显著,P=0.049。雄性小鼠生存后期体重出现下降,呈明显恶液质状态。雌性小鼠的体重、腹水增加虽然较雄性动物明显,但生存期却并不少于雄性鼠,反而比雄性小鼠略长,P=0.1567。结论:性别对小鼠H22腹水型肝癌的生长有一定的差异,雌性小鼠的耐受性优于雄性小鼠。     

十全育真汤对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究十全育真汤对荷瘤小鼠免疫功能的影响,探讨十全育真汤抗肿瘤的作用机制。方法：SPF级雄性昆明种小鼠30只,制成荷H₂₂小鼠肝癌细胞移植瘤模型,随机分为模型组、阳性对照组及十全育真汤组（n=10）;另选择未接种小鼠10只为正常对照组。正常对照组、模型组每天按10 ml/kg灌胃生理盐水及蒸馏水,阳性对照组、十全育真汤组每天按8 g/kg、18 g/kg灌胃参一药液（80 mg/ml）与十全育真汤剂。连续给药14 d后处死小鼠,测量胸腺、脾脏指数及抑瘤率,检测外周血中白细胞、淋巴细胞含量及T细胞亚群CD3、CD4、CD8细胞百分比,血清中白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及干扰素-β（IFN-β）的含量,淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤功能。结果：较正常对照组,十全育真汤组小鼠体重明显增加,脾脏指数显著增大（P<0.05）;白细胞、淋巴细胞CD4、CD8、CD3及TNF-α含量明显升高（P<0.05）;IL-2、IFN-β含量显著下降（P<0.05）;淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤功能明显升高（P<0.05）。与模型组相比,十全育真汤组小鼠胸腺、脾脏指数显著增大（P<0.05）;白细胞、淋巴细胞CD3、CD4、IL-2、IFN-β及TNF-α含量明显升高（P<0.05）,CD8含量则显著降低（P<0.05）;NK细胞杀伤功能及淋巴细胞增殖能力显著增加（P<0.05）。结论：十全育真汤可促进H₂₂荷瘤小鼠免疫器官的生长,增强机体免疫功能,有利于肿瘤机体的恢复。     

同种异体宫内移植小鼠嵌合模型的建立

干细胞宫内移植是一种很有前途的产前治疗方式。为深入研究干细胞移植后的细胞行为,采用宫内移植的方法建立同种异体的嵌合小鼠模型。将雄鼠骨髓单核细胞宫内注射到胎鼠腹腔,在受体鼠出生后检测雌性受体鼠外周血细胞。应用PCR检测外周血是否存在雄性鼠的DNA,并采用定量PCR技术确定其嵌合量;同时用荧光原位杂交（FISH）技术直观观察外周血中雄性来源的细胞。结果表明：共获得4只阳性外周血嵌合小鼠,其中3只稳定嵌合达到6个月以上。应用宫内移植成功建立了外周血中存在异源细胞的小鼠嵌合模型。     

不同来源H22细胞株的生物学特性比较研究

目的　对不同研究单位保存的小鼠肝癌H2 2 细胞株的基本生物学特性进行比较研究。方法　从国内3个不同研究单位 (武汉大学典型培养物保藏中心 ,山东省医学科学院药物研究所以及中国医学科学院药物研究所 )引进小鼠肝癌H2 2 瘤株 (分别简称武汉H2 2 、山东H2 2 、北京H2 2 ) ,KM小鼠腹腔传代 ,然后对其体外培养特性、体内生长特征、病理形态、治疗学特征进行了比较分析。结果　 3株H2 2 细胞在体内、体外生长速度明显不同 ,武汉H2 2 生长速度较其他瘤株快 (P <0 .0 1) ,接种一致性好 ;而山东H2 2 则在 10 4 个细胞 只小鼠时即可接种成功。荷瘤小鼠体内未发现明显转移灶 ,但肿瘤形态各不相同。环磷酰胺治疗时 ,山东H2 2 抑瘤率最高为 74 6%。结论　不同研究单位H2 2 瘤株的生物学特性有很大不同 ,虽为同一起源 ,但经不同单位保存使用一定时间后 ,它们之间的生物学特性已存在较大的差异     

黄瓜香联合顺铂治疗小鼠H22肝癌的研究

目的 观察黄瓜香联合顺铂对小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制作用.方法 将40只接种H22肝癌细胞的昆明小鼠随机分为4组,其腹腔分别注射生理盐水(对照组);黄瓜香组;顺铂组;黄瓜香+顺铂组(联合治疗组),观察小鼠的毒副反应及生存质量.实验19 d后,处死全部小鼠,剥离皮下肿瘤,称小鼠肿瘤重量,计算抑瘤率.结果 黄瓜香组的H22肝癌平均瘤重为(1.26 ±0.19)g,明显低于对照组的(1.89 ±0.56)g(P ＜0.01).联合治疗组的平均瘤重为(0.57 ±0.42)g,均明显低于黄瓜香组(P＜0.01)和顺铂组(P＜0.01);其抑瘤率达69.8％,明显高于黄瓜香组(x2=16.9875,P＜0.01)和顺铂组(x2=5.0602,P＜0.05).联合治疗组小鼠的毒副反应明显低于顺铂组,生存质量好于顺铂组;黄瓜香组与联合治疗组都能调节肠道菌群,扶植肠道中有益菌(乳酸杆菌和双歧杆菌)生长,抑制大肠埃希菌生长,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 黄瓜香与顺铂合用对小鼠H22肝癌移植瘤的生长具有协同抑制作用,能降低顺铂毒副反应,提高小鼠的生存质量.     

褪黑素抗H22细胞增殖的机制研究

目的　采用体内和体外实验观察褪黑素 (melatonin ,MLT)对小鼠肝癌H2 2细胞株的生长抑制作用 ,并探讨其机理。方法　MTT法分析MLT对培养H2 2细胞的抑制作用 ,流式细胞技术 (flowcytometry ,FCM)检测细胞周期分布 ,采用免疫组化方法进行体内和体外P5 3、cyclinE的检测 ,通过RT PCR方法进一步检测 p5 3mRNA水平。结果　 1.MTT显示MLT对H2 2细胞具有极显著抑制作用 (P <0 0 1) ;2 .FCM显示 :MLT可引起H2 2细胞G0 /G1期比例升高 ;3.免疫组化分析显示MLT使体内和体外P5 3蛋白水平显著增高 (P <0 0 1) ,cyclinE水平下降 (P <0 0 1) ,RT PCR方法证明p5 3mRNA水平增高。结论　MLT可引起细胞周期阻滞在G1期 ,其机理可能是通过P5 3抑制cyclinE的表达 ,从而阻止细胞进入S期的结果。     

小鼠正常肝、再生肝和腹水型肝癌H22a细胞酪氨酸蛋白磷酸酶的比较研究

小鼠肝在再生过程中,胞浆酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)活力比正常肝有明显升高,并且伴有时相变化,,手术后24—48h活力达到最高,而H22a细胞各组分的活力都比正常肝低。PTPP在正常肝细胞的溶酶体中分布最高;再生肝中则在细胞核、胞浆和微粒体中更集中;在H22a细胞中,PTPP的活力分布趋于平均化。再生肝和H22a细胞胞浆中都缺少正常肝的a、b两个PTPP活力峰,其它五个主要PTPP峰与正常肝无根本的差别。     

H1N1流感病毒对小鼠胚胎发育表型的影响

H1N1流感病毒属于常见的致病性病毒。流行病学调查研究表明,新生儿表型缺陷与流感病毒感染有关,但是具体机制还不明确。为了探讨H1N1流感病毒对胚胎发育的影响,本文通过流感病毒感染孕母鼠来构建流感病毒宫内感染的动物模型,分别在胚胎发育至E14.5、E15.5、E16.5、E17.5、E18.5 d以及出生1 d后测量各胚胎的体长,并在体视镜下观察胚胎体表各血管和器官来分析胚胎外表发育的情况,然后采用阿尔新蓝-茜素红染色法观察各发育时期胚胎骨骼发育的情况。结果表明,流感病毒感染的小鼠胚胎的体长明显降低。外部器官发育的差异性可体现在眼、耳等器官,攻毒组成型稍晚,尾部异常卷曲更为严重。各骨骼发育攻毒组较对照组更迟缓,但没有出现长短肢或骨骼缺失等严重异常表型。本研究首次构建了流感病毒宫内感染的动物模型,探究了H1N1流感病毒对小鼠胚胎表型发育的影响。     

不同剂量朱砂七总蒽醌对H22荷瘤小鼠免疫功能及抗氧化能力的影响

目的:探讨不同剂量朱砂七总蒽醌对H22荷瘤小鼠免疫功能及抗氧化能力的影响。方法:选取清洁级昆明小鼠60只,按照随机数字表法分为正常对照组、H22荷瘤组、环磷酰胺组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组各10只。除正常对照组外,其余5组小鼠建立H22荷瘤小鼠模型。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予0.3 g/kg、0.6 g/kg、1.2 g/kg的朱砂七总蒽醌悬浊液干预,环磷酰胺组给予0.02 g/kg的环磷酰胺干预,正常对照组和H22荷瘤组给予等剂量的1%的羧甲基纤维素钠干预。比较各组小鼠的肿瘤体质量、抑瘤率、T淋巴细胞亚群以及血清超氧化歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果:环磷酰胺组、高剂量组的肿瘤体质量低于低剂量组,抑瘤率高于低剂量组,差异具有统计学意义(P0.05)。高剂量组的CD4+、CD4+/CD8+均高于环磷酰胺组、低剂量组、中剂量组,CD8+低于环磷酰胺组、低剂量组、中剂量组,差异均有统计学意义(P0.05)。高剂量组血清SOD、GSH-Px水平高于其他5组,MDA、LDH水平低于H22荷瘤组、低剂量组、中剂量组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:朱砂七总蒽醌具有明显的抗肿瘤作用,可增强小鼠的免疫功能和抗氧化能力,且具有剂量效应。     

小鼠电融合四倍体胚胎早期发育的研究

多倍体发育现象在低等动物,尤其是在无脊椎动物中比较普遍,在哺乳动物中多倍体往往发育到胚胎早期就死亡,因而在自然界中不能存活。探讨哺乳类四倍体不能存活的原因是当今生物学研究的热点问题之一。目前,电融合技术是大量获得四倍体胚胎的主要手段。本以8－12周龄昆明小白鼠为实验对象,取其2－细胞胚胎于Whitten氏液中进行电融合,再移入CZB液中培养。电刺激的条件分别为：1．0kv/cm,40μs,和0．8kv/cm,80μs。对融合胚发育的状态、细胞数目及染色体组成等进行观察的结果表明,融合胚培养24小时后发育到4－细胞期,并发生致密化（Tab.1)。融合胚的囊胚形成时间与体内发育的同期胚胎及体外培养的同期二倍体胚胎基本一致（Tab,2;Fig.1)。融合囊胚的细胞数平均为13．0±4．95,显（P＜0．01）少于体外发育囊胚（37．0±5．92）和体内发育囊胚（41．6±2．4）的细胞数（Tab.3)。融合胚各个分裂相的染色体数目分布情况见Fig.2,其四倍体（4n＝80）率为42．86％,非整倍体率达57．14％。而对照组的体内发育囊胚的非整倍体率仅为11．54％;（Tab.4),与Kaufman的结果（12．4％）很接近,说明本实验中的染色体制备技术和分析方法是可行的。融合囊胚的细胞数目减少和高发的非整倍体率可能是四倍体胚胎发育能力差的原因。     

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development.  Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.     

小鼠胚胎循环血中造血祖细胞的发育特点

目的：系统地考察小鼠胚胎循环血中造血祖细胞的发育特征。方法：应用体外集落形成实验、脾结节形成实验、基质细胞OP9或OP9-DL1共培养体系,分别考察胚胎期10．5d（E10．5）和11．5d（E11．5）小鼠胚胎循环血的髓系祖细胞和淋系祖细胞潜能。结果：小鼠胚胎循环血中含有各类髓系祖细胞,E11．5的小鼠胚胎循环血的髓系祖细胞的数量显著增加;同时循环血细胞经体外诱导可产生B、T淋巴细胞。结论：小鼠E10．5-E11．5的胚胎循环血中存在丰富的具有髓系和淋系潜能的前体细胞。     

Expression of Catenins during Mouse Embryonic Development and in Adult Tissues

Classical cadherins are cell-surface glycoproteins that mediate calcium-dependent cell adhesion. The cytoplasmic domain of these glycoproteins is linked to the cytoskeleton through the catenins (α, β and γ). The catenins are intracellular polypeptides that are part of a complex sub-membranous network modulating the adhesive ability of the cells. One approach to elucidate the role of these molecules in the cell is to investigate their distribution during mouse development and in adult tissues. This study reports that catenins are widely expressed but in varying amounts in embryos and adult tissues. The expression of all three catenins is most prominent in the adult heart muscle and in epithelia of all developmental stages. In other embryonic and adult tissues, lower expression of catenins was detected, e.g., in smooth muscle or connective tissue. Catenins are coexpressed with various cadherins in different tissues. Gastrulation is the first time during embryogenesis when a discrepancy occurs between the expression of catenins and E-cadherin. E-cadherin expression is suppressed in mesodermal cells but not the expression of catenins. This discrepancy suggests that another cadherin may interact with catenins. Similarly, E-cadherin is generally expressed in adult liver but not in the regions surrounding the central veins. In contrast, catenins are uniformly expressed in the liver, suggesting that they are associated with other cadherins in E-cadherin negative cells. Finally, the three catenins are not always concurrently expressed. For example, in peripheral nerves, only β-catenin is observable, and in smooth muscle plakoglobin is not detectable.     

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O₂ / 5% CO₂ in a rolling bottle culture apparatus at 37 °​C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.     

Figla基因过表达促进小鼠胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化

生殖系a因子(Figla）是最早表达的生殖细胞特异性转录因子之一,对卵泡的发育、Zp基因的表达和透明带的形成具有调节作用. Figla基因异常会引起卵巢早衰的发生. 本研究通过 PCR自小鼠基因组中扩增出Figla基因,将其克隆到真核报告载体pDsRed1 N1,构建了携带609 bp 的Figla重组载体pDsRed1 N1 Figla. 用该载体转染小鼠胚胎干细胞（mESCs）系J1、小鼠成纤维细胞系NIH 3T3、小鼠畸胎瘤细胞P19和小鼠精原细胞系GC1,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)在细胞中的表达,同时检测转染细胞中Figla基因及其它生殖细胞特异性基因的表达. 结果显示,转染2 d,mESCs内Figla总表达量明显增加,且内源性表达量亦有所提高,即转入的外源性Figla基因可以促进内源性Figla的启动和表达. 免疫荧光染色显示,表达RFP 的细胞同时表达生殖特异性基因Vasa,减数分裂特异性基因Stra8、Scp3及卵母细胞标志基因Zp3. 通过QRT PCR检测发现,在转染3 d的细胞中,Vasa、Scp3和Zp1的表达较对照组均有明显上调,而Oct4和Stra8的表达量下降. 研究表明,Figla基因对生殖特异性基因的表达具有调控作用,可以激活雌性生殖基因表达,为更清楚地了解Figla基因在生殖细胞生长发育过程中的调控机制,以及发现该基因在生殖细胞中的新功能奠定了基础.     

Activation of Mouse Oocytes, Fertilization and Development of Mouse Embryos in Vitro after Staining with Trypan Blue or Fluorescein Diacetate

The influence of vital staining with trypan blue or fluorescein diacetate on the fertilization of mouse oocytes and the developmental potential of mouse embryos was assessed. Neither stain induced spontaneous activation in mouse oocytes, nor did they impair the in vitro development and implantation of mouse zygotes, two-cell embryos, stressed morulae or blastocysts. However, fertilization and subsequent development of mouse oocytes have been shown to be reduced by vital staining.     

利用核定位信号筛选系统初步筛选小鼠胚胎核定位蛋白基因

在已建立的核定位信号 (nuclearlocalizationsignal,NLS)筛选系统的基础上 ,对这一系统进行了改进并对改进的系统进行了验证。将小鼠 1 1天胚胎cDNA文库插入改进后的筛选载体的多克隆位点 ,转化酵母宿主菌。然后将约 1 0 4 个酵母克隆接种于选择性平板上进行筛选 ,得到了 2 2个可在选择性培养基上生长的克隆。分析了其中 1 8个克隆的DNA序列 ,见到 1 3个克隆含有以正确读框融合的编码NLS的基因片段。取其中 3个克隆的插入片段与绿色荧光蛋白基因融合后在哺乳类细胞内表达 ,证明了其在哺乳类细胞中的核定位功能。研究证明 ,构建的核定位信号筛选系统 ,能够有效地从cDNA文库中筛选核定位蛋白的基因     

昆明白小鼠胚胎干细胞分离与体外培养

为探索昆明白小鼠胚胎干细胞建系方法,将受孕4.5天的昆明白小鼠囊胚用免疫手术法去除滋胚层,然后将内细胞团(ICM)接种于胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,形成的胚胎干细胞样集落用胰蛋白酶-EDTA消化法传代,培养后进行相差显微镜观察及碱性磷酸酶染色。结果饲养层上生长的ICM细胞呈典型的ES样细胞集落,传至第8代碱性磷酸酶染色呈强阳性。实验表明免疫手术法适用于昆明白小鼠ES细胞建系,获得的细胞集落具有ES细胞的主要生物学性状。