硫酸铵与盐酸胍对鸡肝二氢叶酸还原酶的激活和失活作用

在５℃、２０℃、３０℃,鸡肝二氢叶酸还原酶的活力随盐酸胍浓度增加,先经历一个激活区,以后则为失活区。温度升高,使最大激活幅度变小,激活区变窄,所需盐酸胍浓度减小,硫酸铵在浓度低于０．２ｍｏｌ／Ｌ时,对天然酶有较小的激活作用,更高浓度的硫酸铵使酶活力下降;胍激活酶的活力随硫酸铵浓度的增加,由天然酶的２１０％单调下降;对失活酶,增加硫酸铵的浓度,则使酶活力逐渐恢复;三种情形的终活力均为天然酶的４０％。     

大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因folA的克隆、表达纯化及分子间交联

利用PCR技术从大肠杆菌DH5α中获取二氢叶酸还原酶(DHFR)基因folA。用限制性内切酶BamHI与PstI将该片段插入到克隆载体pUC18上,DNA测序鉴定目的基因。而后再将该基因亚克隆到表达载体pTrcHisC上,IPTG诱导表达重组蛋白。在非变性条件下,用TALON金属亲和层析树脂纯化含组氨酸标记的重组DHFR。纯化产物在热诱导条件下行SDSPAGE分析,除23000大小的单体外,还出现了交联的二聚体和多聚体;而当反应体系中含有还原剂β-巯基乙醇时,二聚体和多聚体都被减弱。推断蛋白质在热诱导条件下二级结构发生改变而产生交联,并且有二硫键的参与。     

二氢叶酸还原酶天然状态可能存在两种构象

鸡肝二氢叶酸还原酶（ＤＨＦＲ）平衡态的去折叠曲线符合二态模型,但在４．０ｍｏｌ／Ｌ脲中的去折叠动力学为两相。该酶的ＡｒｒｅｈｉｕｓＰｌｏｔ有一个拐点,但在低浓度变性剂存在下,拐点消失。用二氢叶酸还原酶的天然状态存在两种构象可以很好地解释上述现象。二氢叶酸还原酶去折叠过程中没有稳定存在的中间体,动力学过程中的两相可能是两种天然构象态的去折叠速度常数不同造成的。ＡｒｒｅｈｉｕｓＰｌｏｔ的拐点是由于在不同的温度条件下,两种天然构象的含量不同造成的,低浓度变性剂对两种构象的影响不同,使拐点消失。ＫＣｌ可以改变两种构象的平衡     

盐酸胍诱导的α淀粉酶去折叠与再折叠

利用蛋白质内源荧光和酶活性两种信号以及荧光偏振,HPLC和停流等方法研究了盐酸胍诱导的α淀粉酶去折叠与重折叠的平衡转变和动力学。实验结果表明α淀粉酶去折叠与重折叠是两个不同的过程;变性与复性过程中可能伴有聚集体生成;去折叠与重折叠均为双相过程,重折叠大约始于2秒之后。     

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用

目的观察二氢叶酸还原酶基因(DHFR)功能阻抑斑马鱼胚胎的颅脑部发育情况,初步探讨二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用。方法采用显微注射吗啡啉修饰的反义核苷酸(MO)的方法进行DHFR表达阻抑。胚胎发育至受精后48hpf观察胚胎的颅部发育情况,在60hpf时经石蜡切片进一步观察胚胎的脑发育状况。利用胚胎整体原位杂交的方法检测影响神经系统发育的关键因子ngn1和huc的表达情况。结果显微注射MO可成功的进行DHFR表达阻抑。DHFR表达阻抑组胚胎存在颅脑部发育明显异常和ngn1、huc的表达强度明显减弱,且与显微注射的MO剂量呈正相关。结论DHFR在斑马鱼颅脑发育中有重要作用;其功能阻抑可导致胚胎颅脑部发育异常,其机理与ngn1和huc的的表达减弱有关。     

中华猕猴桃蛋白酶在盐酸胍中分子折叠与活力的关系

中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin)在盐酸胍溶液中活力变化结果提示:酶在0.1mol/L胍中活力略有升高,随胍浓度增大,活力先经历一个陡降区,在1—2mol/L胍中有个稳定区域,随胍浓度增大,活力继续下降。同时以荧光光谱,圆二色光谱研究该酶分子的构象变化。结果表明引起酶构象发生明显变化所需胍浓度(3mol/L)远比酶明显失活所需胍浓度(0.5mol/L)大。相同胍浓度下酶活力丧失速度快于构象变化速度。经5mol/L胍变性的酶直接稀释至胍浓度为0.05mol/L时,酶活力不能恢复,而构象迅速恢复。失活酶先稀释至胍浓度为1—2mol/L、再进一步稀释至胍浓度为0.05mol/L,活力能恢复50％左右。以上结果表明,相对于整个酶分子来说,活性中心的构象变化对变性剂更敏感。Actinidin的失活及复活过程是多相的复杂过程。     

新载体pET-DB对带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶的高效表达与纯化

报道了带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶基因的克隆和在DB序列增强下T7启动子调控该基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达,SDS-PAGE分析表明,带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶的含量可占大肠杆菌细胞总蛋白质含量的46%.该酶的纯化可用常规的金属络合树脂一步纯化至SDS-PAGE一条带,经凝血酶切去His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶与用等电聚焦法获得的无His-tag的酶有相同的酶活性.     

二氢叶酸还原酶结合底物的去除

分析了应用氨甲蝶呤（MTX-Agarose）亲和层析法提纯的鸡肝二氢叶酸还原酶的组成和性质.建立了用平面粒度胶等电聚焦法去除与酶紧密结合底物的方法．讨论了结合底物对酶构象研究的影响,并指出,用未完全去除结合底物的酶研究酶在变性过程构象变化会得到错误的结论．     

盐酸胍诱导的α淀粉酶去折叠与再折叠

利用蛋白质内源荧光和酶活性两种信号以及荧光偏振,ＨＰＬＣ和停流等方法研究了盐酸胍诱导的α淀粉酶去折叠与重折叠的平衡转变和动力学。实验结果表明α淀粉酶去折叠与重折叠是两个不同的过程;变性与复性过程中可能伴有聚集体生成;去折叠与重折叠均为双相过程,重折叠大约始于２秒之后。     

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼咽弓发育过程中作用的研究

叶酸缺乏可导致胚胎先天性发育异常,二氢叶酸还原酶是叶酸生物学作用通路中的关键因子,其功能阻抑将抑制叶酸生物学作用的发挥.咽弓是脊椎动物胚胎发育中头面部结构、心脏流出道等的共同前体.在模式生物斑马鱼中,利用基因表达阻抑以及过表达技术,探讨二氢叶酸还原酶基因(DHFR)在斑马鱼咽弓发育过程中的作用.石蜡切片以及软骨染色结果显示,DHFR表达阻抑导致斑马鱼咽弓以及腭发育明显异常,而DHFR过表达可部分挽救上述发育异常表型.TBX1和HAND2在咽弓发育中有重要作用.通过胚胎整体原位杂交以及Real-timePCR技术检测TBX1和HAND2表达水平.DHFR表达阻抑后TBX1和HAND2的表达降低,DHFR过表达可使TBX1和HAND2的表达增加.上述结果表明,DHFR在斑马鱼咽弓发育过程中扮演重要角色,DHFR通过影响TBX1和HAND2的表达而调控咽弓的形成和分化.     

中华仓鼠二氢叶酸还原酶的酶学性质研究

测定中华仓鼠二氢叶酸还原酶（ＤＨＦＲ,Ｅ．Ｃ．１．５．１．３．）催化反应的各个动力学常数,对其反应机制进行了研究。测定了不同浓度脲溶液中酶与底物的解离常数Ｋｄ和表观米氏常数Ｋｍ,结果表明酶与底物二氢叶酸（ＤＨＦ）和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰＨ）的结合能力相差很小,都随脲浓度增加而减弱,而且一种底物的结合会削弱酶与另一底物的结合能力。研究了ＤＨＦＲ在脲变性过程中活力和构象的变化,结果表明低浓度脲可使稳态酶活力增强,此时酶的内源荧光发射光谱和ＣＤ谱变化很小;随脲浓度的增加,酶逐渐失活,同时荧光光谱的最大发射峰位红移,荧光强度和椭圆率也明显下降,说明酶活力的变化先于酶分子整体构象的变化,酶活性部位位于比酶分子整体更易受变性剂影响的有限区域,而且酶分子这种相对的和一定限度内的柔性是其表现生物活性所必需的     

溶剂极性及盐酸胍对碳酸酐酶构象的影响

以紫外荧光光谱为检测手段,比较研究了溶剂极性及盐酸胍对碳酸酐酶构象的影响,结果表明,当盐酸胍浓度小于１ｍｏｌ／Ｌ时酶呈天然构象,１．５ｍｏｌ／Ｌ－２．０ｍｏｌ／Ｌ的盐酸胍导致该酶呈伸展构象;而乙醇不以导致该酶产生稳定的中间态构象,１ｍｏｌ／Ｌ和３ｍｏｌ／Ｌ的甲醇以及３ｍｏｌ／Ｌ的乙醇对盐酸胍致碳酸酐酶中间态的影响不大,甲醇略使致中间态的盐酸胍浓度下降,乙醇略使之上升。     

盐酸己烷基双胍对肌酸激酶的活力及构象的影响

测定了盐酸己烷基双胍(C_6H_(13)C_2N_5H_(?)HCl;记为HBGC)对肌酸激酶(Creatine Kinase;记为CK)的活力的影响;同时利用荧光光谱,紫外差光谱.付里叶红外光谱等手段测定了HBGC对CK构象的影响,结果表明.HBGC为0.07mol时就使CK完全失活、而且在高浓度的HBGC中变性后的CK.稀释时即可完全复活;CK的活力丧失明显先于构象的变化,与溴化+烷基三甲铵不同,HBGC可以破坏CK的二级结构,使之完全无序化.     

盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响

研究人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ,Ｅ．Ｃ．３．１．３．１）在胍变性过程中构象与活力的变化;测定胍存在时酶的表观米氏常数（Ｋｍ）。结果表明,低浓度的盐酸胍（＜０．５ｍｏｌ／Ｌ）使变性平衡态酶的发射荧光强度略有下降,酶活力增强;随盐酸胍浓度的增加,其荧光强度不仅不再下降,反而升高,酶逐渐失活;当盐酸胍浓度为１．５ｍｏｌ／Ｌ时,其荧光光谱的最大峰位红移,酶活力迅速下降;当盐酸胍浓度为３ｍｏｌ／Ｌ时,峰位由３３３．５ｎｍ红移至３５７．１ｎｍ,此时酶活力丧失;当盐酸胍浓度为４ｍｏｌ／Ｌ时,峰位不再红移,但其荧光强度继续增加。测得变性初态酶的表观Ｋｍ值随盐酸胍浓度的增加而增大。结果说明,荧光强度的增加和最大发射峰位的红移是该酶变性失活的一个灵敏指标;酶活力的变化明显快于酶分子整体构象的变化;低浓度的盐酸胍微扰了酶活性部位的构象,而对其整体构象无显著影响。提示酶活性部位具有柔性。     

新型甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶DfrB7的生化分析与宿主菌耐药机制研究

【目的】分析新型甲氧苄啶获得性耐药蛋白DfrB7的生化性质,探究其与B家族代表性的二氢叶酸还原酶(DHFR)对甲氧苄啶获得性耐药的生化基础。【方法】构建系统进化树分析B家族DHFRs与新型DfrB7的进化关系。将dfr基因分别构建到pACYC184和pET15b(+)载体并转化到相应大肠杆菌中。使用微量肉汤稀释法确定克隆菌株对甲氧苄啶的耐药性。测定DHFRs使用NADPH作为质子供体催化二氢叶酸还原的酶活反应参数。通过等温滴定量热法测定甲氧苄啶的解离常数。【结果】克隆到大肠杆菌中的新型dfrB7基因表现出对甲氧苄啶的高耐药表型。系统进化树确定了dfrB7编码B家族的DHFRs。检测并比较DfrB7和代表性DHFRs的酶活性质、抑制剂的亲和力,与染色体上DHFR相比,DfrB7与DfrB1均表现出显著降低的催化活性,通过生化实验证实B家族二氢叶酸还原酶对甲氧苄啶结合力极差。【结论】新型dfrB7基因编码的DfrB7具有B家族二氢叶酸还原酶的普遍特征。B家族二氢叶酸还原酶赋予宿主菌对甲氧苄啶的获得性耐药与该酶对甲氧苄啶的低亲和力有关。     

α-淀粉酶在盐酸胍和碳酸胍变性中有关胍基作用的研究

利用紫外差谱、荧光光谱和园二色谱法对比地研究了α-淀粉酶盐酸胍和碳酸胍变性,分析了两种胍变性明显差异的原因。通过等同的胍基浓度下,α-淀粉酶两种胍变性的构象变化与活性关系的实验,表明同等摩尔浓度的两种胍盐变性能力上的明显差异并不主要是由于它们胍基含量上的不同。将盐酸胍从中性pH(6.5)调至碱性pH(10.4),其变性能力大增,紫外差谱与碳酸胍变性相似,出现了290nm的正肩和296nm的正峰,与此同时,酶的荧光强度大大降低,大部分酶活性丧失。由此推论,两种胍变性能力的明显差异的重要原因之一是在碱性介质中胍基的变性能力明显增强,并分析了其增强的原因。     

无花果蛋白酶在胍溶液中的分子折叠与活力变化研究

本文研究无花果蛋白酶（ＥＣ．３．４．４．１２）在不同浓度盐酸胍溶液中分子构象与活力变化关系。酶的内源荧光光谱,圆二色光谱与酶活力的变化表明：荧光光谱呈现二个明显的变化区域,低浓度胍（低于２ｍｏｌ／Ｌ）中,荧光发射峰基本不变,但荧光强度随胍浓度上升,随胍浓度断续增大（高于２ｍｏｌ／Ｌ）,酶的最大发射波长明显红移。当胍浓度低于１ｍｏｌ／Ｌ时,不仅不会使酶失活,反而使酶激活,当胍浓度高于１ｍｏｌ／Ｌ以上     

中国仓鼠卵细胞二氢叶酸还原酶基因在大肠杆菌中的高效表达

本工作采用PCR法将哺乳动物表达载体pSVA75上的中国仓鼠卵细胞(CHO)二氢叶酸还原酶基因扩增后插入到原核生物高效表达质料pBV221中,构建成胞内表达载体pDHFR-1,经转化大肠杆菌(E.coli DH5α)后获高效表达,表达量占总蛋白量的12.2%。利用这种方法不仅为深入研究该酶的结构和功能的关系及其新生肽链的折叠提供丰富的实验材料,而且也有希望成为较好的外源DNA原核扩增表达系统。 Abstract:The technique of PCR was used to amplify the Chinese Hamster Ovary DHFR gene in the mammal expression vector pSVA75,and the amplified fragments were inserted into the vector pBV221,to construct the vector pDHFR-1.The CHO dhfr was fransformaed into E.coli DH5α and high-level expressed.The scanning results(scanned by LKB Enhanced Laser Densitometer)showed that the expression level had reached 12.2% of the total cellular proteins.Therefore,this provides an abundant experimental material for studying the relationship between the protein construct and function,and for studying the biology of the nascent peptide chain during biosynthesis.This pathway may be a good expression system of prokaryocyte for amphifing eukaryotic gene.