天花粉蛋白与FMP复合物的晶体结构

用浸泡法得到了天花粉蛋白（ＴＣＳ）与ＦＭＰ复合物的晶体,在ＳＩＭＥＮＮＳＸ－２００Ｂ面探测器系统上收集了一套２．０分辨率的Ｘ射线衍射数据。用同晶差值傅立叶法解析了复合物的结构,经Ｘ—ＰＬＯＲ程序修正得到了ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物的分子结构并找出了１９７个水分子,最后的Ｒ因子为０．１７２,键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．０１５和２．９２２度。ＴＣＳ—ＦＭＰ复合物中,ＦＭＰ与天花粉蛋白分子有较好的结合,其结合位置正处于根据三维结构和突变体信息推测的Ｎ一糖苷酶活性口袋之中。它的类嘌呤环夹在Ｙ７０和Ｙ１１１两个侧链环之间,与Ｙ７０环近乎平行,其Ｎ７和Ｎ６分别与ＴＣＳ分子的Ｇ１０９４羰基氧和Ｉ７１的Ｎ成氢键,Ｎ３靠近Ｒ１６３的侧链,其磷酸根则伸向活性口袋的底部,与Ｅ１８９、Ｅ１６０和Ｒ１６３等残基作用。     

亚天花粉蛋白突变体(R163H n-TCS和R163Q n-TCS)的晶体结构研究

用悬滴汽相扩散法得到了Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ和Ｒ６１３Ｑｎ－ＴＣＳ的晶体,Ｍａｒ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２００和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ－射线衍射数据,采用同晶差值傅立叶法解析结构,用Ｘ－ＰＬＯＲ软件包进行修正,最后的晶体学Ｒ因子分别为０．１８４和０．１８５,键长偏差分别为０．００１３ｎｍ和０．００１４ｎｍ,键角偏差分别为２．５９０和２．８１５,结构测定显示Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ     

亚天花粉蛋白突变体R163Kn-TCS及其复合物R163Kn-TCS/Ade的晶体结构

用悬滴汽相扩散法得到Ｒ１６３Ｋ ｎ－ＴＣＳ的晶体,并用ＡＭＰ浸泡４８小时后利到复合物晶体。在Ｍａｒ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２０５和０．１８７分辨率的Ｘ－射线衍射数据。采用同晶差值傅立叶法解析结构,用Ｘ－ＰＬＯＲ软件包进行修正,最后两模型的偏差因子（Ｒ和Ｒｆｒｅｅ）分别为（０．１８７和０．２６３）和（０．１８０和０．２３３）,键长偏差都为０．００１３ｎｍ,键角偏差分别为２．７９     

(E160A)和(E160D)天花粉蛋白两种突变体晶体结构研究

培养了（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ和（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ的单晶。在ＭＡＲＲｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．１９３ｎｍ和０．２０ｎｍ分辨率的Ｘ射线衍射数据。数据处理用ＭＡＲＳＣＡＬＥ程序系统完成。用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ法解析了突变体的晶体结构,结构修正利用Ｘ－ＰＬＯＲ程序。修正结果,晶体学Ｒ因子分别为０．１７５,０．１７９,键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．００１１ｎｍ和２．４５７°,０．００１３ｎｍ和２．６７５°。在这两个突变体的结构中均未见到Ｇｌｕ１８９侧链方向的改变。通过对（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ和（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ的结构比较,说明（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ活性低于（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ的原因：这可能是由于在（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ中Ｔｙｒ１１１和Ｔｙｒ７０的侧链都具有较大的运动性,使它们与腺嘌呤碱基的芳香堆垛作用减弱,从而导致活性的降低     

天花粉蛋白Glu189在N-糖苷酶活性中的作用

培养了(E160A,E189A)TCS(天花粉蛋白)的单晶。用浸泡法得到了(E160A,E189A)TCS与Ade复合物的晶体。在MarResearch面探测器系统上分别收集了均为0.20nm分辨率的X射线衍射数据,数据处理用MarScale程序系统完成。用同晶差值Fourier法解析了(E160A,E189A)TCS和(E160A,E189A)TCS-Ade的晶体结构,结构修正利用X-PLOR程序.修正结果,晶体学R因子分别为0.180、0.184,键长和键角的RMS偏差分别为0.0012nm和2.566°、0.0012nm和2.622°。在(E160A,E189A)TCS-Ade中,Ade仍结合在N-糖苷酶活性口袋之中,它夹在Tyr70和Tyr111两个侧链环之间,与Tyr70环近乎平行。这一结果表明:TCS中的Glu160和Glu189同时突变成Ala,仍能与AMP发生N-糖苷酶反应.前文已经证明在(E160A)TCS中Glu189没有援救作用。目前,没有发现Glu189对TCS与AMP的直接作用,但Glu189与其它残基的协同作用及其在TCS与rRNA作用中扮演什么角色,尚待进一步研究。     

天花粉蛋白Glu160在N-糖苷酶活性中的作用

用浸泡法得到了（Ｅ１６０Ａ）天花粉蛋白（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ, ＴＣＳ）,（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ与Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ与ＦＭＰ复合物的晶体．在Ｍａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 面探测器系统上分别收集了０．２０ ｎｍ ,０．１９ｎｍ 和０．２０５ ｎｍ 分辨率的Ｘ 射线衍射数据,数据处理用Ｍａｒ Ｓｃａｌｅ 程序系统完成．用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ法解析了（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－Ａｄｅ,（Ｅ１６０Ｄ）ＴＣＳ－Ａｄｅ 和（Ｅ１６０Ａ）ＴＣＳ－ＦＭＰ的晶体结构,结构修正利用Ｘ－ＰＬＯＲ程序,修正结果,晶体学Ｒ因子分别为０．１６６,０．１７６,０．１７９．键长和键角的ＲＭＳ偏差分别为０．００１０ ｎｍ 和２．５０３°,０．００１３ ｎｍ 和２．６６５°,０．００１２ ｎｍ 和２．６７６°．在这三个结构中均未见到Ｇｌｕ１８９侧链方向的改变．Ａｄｅ 或ＦＭＰ仍结合在Ｎ－糖苷酶活性口袋之中,它夹在Ｔｙｒ７０和Ｔｙｒ１１１两个侧链环之间,与Ｔｙｒ７０环近乎平行．这一结果表明：ＴＣＳ中的Ｇｌｕ１６０分别突变成Ａｌａ 和Ａｓｐ,仍能与ＡＭＰ发生Ｎ－糖苷酶反应,但是活性降低了一些．可见Ｇｌｕ１６０对ＴＣＳ与ＡＭＰ的作用是重要的,但不是必要的．     

亚天花粉蛋白突变体(R163H n－TCS和R163Q n－TCS)的晶体结构研究＊

用悬滴汽相扩散法得到了R163H n－TCS和R613Q n－TCS的晶体, 在Mar－Research面探测器系统上分别收集了0.200和0.205nm分辨率的X－射线衍射数据。采用同晶差值傅立叶法解析结构, 用X－PLOR软件包进行修正, 最后的晶体学R因子分别为0.184和0.185, 键长偏差分别为0.0013nm和0.0014nm, 键角偏差分别为2.590°和2.815°。结构测定显示R163H n－TCS和R163Q n－TCS与n－TCS的主链结构无较大变化, 活性口袋区的结构和氢键体系发生了明显变化。生化分析表明R163H n－TCS具有糖苷酶活性,R163Q n－TCS没有糖苷酶活性。这说明,第163位侧链的H＋对n－TCS发挥N－糖苷酶活性至关重要。     

天花粉蛋白N-糖苷酶作用的机制

用晶体学方法分别研究了TCS与AMP ,Ado ,tub ,CMP的相互作用 .确证了TCS专一性识别Ade,嘧啶环不识别 ,而用TCS与单核苷酸作用 ,磷酸根存在与否并不重要 ;R1 6 3胍基的H⁺被Ade的N3共享 ,而不是N7接受质子 .丰富了TCS与AMP相互作用的N 糖苷酶作用机制模型 .此模型也应该适用于RIPs与AMP的相互作用 ,反映了RIP与rRNA作用的基本模式 ,但是 ,RIP与rRNA的作用会更复杂 ,要全面了解RIPs对rRNA的识别与催化 ,还应该探索RIP与rRNA中包括GAGA茎环区底物类似物复合物的三维结构 .     

天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术,对天然天花粉蛋白（ｎＴＣＳ）基因在Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２两个保守残基处同时进行定点突变,即Ｔｙｒ１４变成Ｐｈｅ,Ａｒｇ２２变成Ｌｅｕ,然后克隆到ｐＥＴ－８ｃ高效表达载体上,构建成重组质粒ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ．经序列分析,定点突变的结果与预先设计的完全一致,突变后的天花粉蛋白命名为Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ．将ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ转化到Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＬｙｓＳ）中,进行表达．经ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,纯度可达９０％．ＲＩＰ活性测定显示,Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ的活性比ｎＴＣＳ降低了７．５倍,活性变化不显著,因此,ＴＣＳ的Ｔｒｙ１４和Ａｒｇ２２对维持其活性部位构象并不是必需的．但由于Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达量与ｎＴＣＳ相比明显下降,因此,Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２可能与ＴＣＳ翻译后的折叠有关．     

高分辨率高精度天花粉晶体结构研究 1．1分辨率衍射数据的收集

以同步辐射作为Ｘ射线源,在Ｓａｋｓｂｅ无屏Ｗｅｉｓｓｅｎｂｕｒｇ Ｘ－射线衍射数据收集系统上,应用磷光可逆成像屏作为记录装置,收集了天花粉蛋白正交晶体１．１Ａ分辨率的衍射数据。经ＷＥＩＳ程序处理和合并后,并获得独立衍射点６７．３２７个,占１．１Ａ分辨率范围应有反射总数的６９．８％;Ｒｍｅｒｇｅ＝５．９０％,表明数据的质量优良,这为特高分辨率天花粉蛋白的晶体结构研究奠定了坚实基础。     

天花粉蛋白基因的克隆及序列分析

本文应用ＤＮＡ多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术,从括楼基因组ＤＮＡ中扩增并克隆了天花粉蛋白（ＴＣＳ）基因。核酸序列分析结果表明,克隆片段包括ＴＣＳ的前原蛋白的编码序列和５＇一侧翼区段。其编码序列与已发表的不同来源的３种ＴＣＳ基因的核苷酸序列的同源性分别为９９．２０％,９８．７４％和９８．６４％。推导出的氨基酸序列与已发表的４种ＴＣＳ的氨基酸序列的同源性分别为９８．６２％、９８．６２％、９７．４１％和９     

天花粉蛋白R122G突变体的构建及活性研究

天花粉蛋白Ｒ１２２Ｇ突变体的构建及活性研究袁惠东１柯一保孔梅柯欣永夏其昌１张祖传１聂慧玲＊（中国科学院上海细胞生物学研究所,上海２０００３１;１中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）关键词天花粉蛋白;突变体;ＲＮＡＮ－糖苷酶天花粉蛋白（ｔｒ...     

天花粉蛋白与膜脂相互作用的研究

天花粉蛋白（ＴＣＳ）在≥２．２２μｍｏｌ／Ｌ时能引起大豆磷脂脂质体内含物释放,Ｃａ＾２＋对这种释放有一定的促进作用,低ＰＨ值也能促进ＴＣＳ与脂质体的作用;将ＴＣＳ与细细胞一起保温;当ＴＣＳ终浓度达１４．７μｍｏｌ／Ｌ时能损伤红细胞膜,产生溶血作用;ＴＣＳ还能作用于红细胞血影膜,改变其脂双层的不对称性。     

利用栝楼发根生产天花粉蛋白的研究

利用发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)菌株 R1 60 1 ,成功地从药用植物栝楼 (Trichosantheskirilowii Maxim.)中诱导出发根并建立了栝楼发根的离体培养系统。通过蛋白质印迹法对栝楼发根的天花粉蛋白进行了鉴定。利用 SDS- PAGE和 TLC扫描 ,测定出每克鲜重栝楼发根中天花粉蛋白的含量可达 8.1 6mg。     

天花粉蛋白引起敏感细胞膜上G蛋白激活的初步研究

Trichosanthin (TCS), a Type I Ribosome Inactivating Protein isolated from the root tuber of Trichosanthes Kirilowii M. has various biological activities including abortion induction, anti-tumor and anti-HIV. The mechanism of TCS specifically killing sensitive cells has not been studied clearly. In this study, we initially found that there exists TCS-affinity molecule on Syncytiotrophoblast cells and Jar cells. Furthermore, by [35S]GTP gamma S Binding Assay, we find that TCS can activate G protein on the membrane of TCS-sensitive cells. These results indicate that on the membrane of TCS-sensitive cells exists TCS-specific receptor.     

天花粉蛋白基因转化番茄的研究

核糖体失活蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ,ＲＩＰ）是一类作用于核糖体,抑制蛋白质合成的蛋白毒素,它具有广谱抗植物病毒和动物病毒的活性,在异种植物中的抗性效应尤其明显。迄今为止,人们已经从５０多种植物中分离出６０多种不...     

在不同物理化学条件下天花粉蛋白的圆二色性研究

用圆二色谱研究了天花粉蛋白在酸性和碱性溶液中的构象,并观察了在十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中天花粉蛋白分子构象的变化,用Chen,Yang与Martinez等人的方法计算了各种条件下天花粉蛋白二级结构含量.结果表明:在很宽广的pH范围内(从pH2到pH12)分子构象基本上是稳定的.但是,在强碱性条件下即pH>12(室温)或pH11.5(40℃)螺旋含量显著减少.在碱性条件下,于250nm附近出现一新的CD带,它的强度与离解的酪氨酸残基个数呈线性关系,说明这一新带主要是由离解的酪氨酸残基产生的.