枯草杆菌蛋白酶E的156和165位突变

应用定点突变方法,在M222A突变的枯草杆菌蛋白酶E基因上进行E156S和V165I定点突变. 将突变基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pBE-2中,在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DB104中进行表达,得到突变种(M222A,E156S)和(M222A,E156S,V165I)蛋白酶E. 性质测定表明,E156S突变使蛋白酶比活力增加90%,并不影响酶的热稳定性和抗氧化性. 而V165I突变使蛋白酶比活力降低.     

台湾家白蚁内切葡聚糖酶活性中心氨基酸的饱和突变

对内切葡聚糖酶的功能改进一直是纤维素酶研究领域的焦点。本研究对台湾家白蚁内切葡聚糖酶(CfEG)的活性位点做了饱和突变。首先,以PDB数据库中高山象白蚁内切葡聚糖酶(NtEG)的三维结构(PDB id=1ks8)为模板,对CfEG进行三维结构同源建模,二者序列一致性高达79%。位于CfEG活性中心的D53、D56、E411,分别与NtEG的催化残基D54、D57、E412重合。用简并引物对CfEG的假定活性位点D53、D56、E411进行定点饱和突变。在位点D53、D56各筛选到羧甲基纤维素酶活有一定提高的突变子D53E、D56C,其中D56C的Km值减小为原始酶的三分之一。双突变子D53L/D56I的比活比原始酶提高了近2倍,同时Km值减小至原始酶的一半。而E411的饱和突变子库均没有活性,进一步将其替换为近似氨基酸的E411D、E411Q定点突变子也丧失了酶活。由突变结果可推断,位点E411为该酶行使功能的必需残基。     

枯草杆菌碱性蛋白酶Ki 2基因的序列测定及M222A定点突变

含有枯草杆菌碱性蛋白酶Ｋｉ-２基因的１.９ｋｂＤＮＡ片段用限制酶切成几个小片段,将这些片段分别插入Ｍ１３ｍｐ１８或Ｍ１３ｍｐ１９中,用通用测序引物测得全序列。所得全序列与蛋白酶Ｅ相比较,在结构基因部分仅有８个碱基不同,由此而导致两个氨基酸的差异。此１.９ｋｂ的片段插入枯草杆菌大肠杆菌穿梭质粒Ｐｂｅ-２,得到的重组质粒转化蛋白酶缺陷型的枯草芽孢杆菌ＤＢ１０４,结果表明枯草杆菌碱性蛋白酶Ｋｉ-２基因在ＤＢ１０４中能利用自身的调控元件表达并分泌到胞外。将Ｋｉ-２蛋白酶的２２２位甲硫氨酸突变成丙氨酸,突变后的Ｋｉ-２蛋白酶具有抗氧化性,但比活性比野生型的约低１倍     

枯草杆菌manA基因的克隆及定点突变

manA是编码β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannan mannohydrolase EC3.2.1.78)的基因。将枯草杆菌A33株的manA基因插入到pET-32a载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源非融合表达,表达活力为41.58U/mL。为了提高酶的表达活力,当采用PCR介导的定点突变技术将该基因第2号密码子CUU突变为GUU,构建成突变表达载体pET-32a-manA*并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,目标酶表达活力增加到138.65U/mL。说明当β-甘露聚糖酶N端第二号氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸后,酶在大肠杆菌中的表达活力大大提高。推测是由于突变后的β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中的稳定性增强所致。突变表达的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH值并没有发生明显改变。     

定点突变提高D-氨甲酰水解酶的可溶性表达

采用定点突变的方法对皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)来源的D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase,DCase)编码基因的3个位点A18、Y30、K34进行突变,并将获得的突变体基因片段构建入高表达载体pET-28b中,转化E coli BL21( DE3),获得带有组合三突变(A18E/Y30D/K34E)的DCase-SM表达菌株BL21/pET-DCSM.当以IPTG诱导目的蛋白表达时,发现突变菌株(DCase-SM)与出发菌株(DCase)菌株相比,目的蛋白的可溶性表达显著提高,其可溶蛋白比例约为64％;与出发菌株相比,其单位菌体酶活增加427％;另外,与本实验室前期构建的高可溶性三叠加突变体菌株DCase-M3相比,单位菌体酶活亦增加7.9％.     

NisinZ的定点突变及突变体性质的研究

以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ2 0 1为模板 ,采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第 8位Thr突变为Ser(T8S)、将第 2位Dhb突变为Dha和第 31位His突变为Lys(T2S H31K)以及将第 2 7位Asn突变为Lys和第 31位His突变为Lys(N2 7K H31K) ,以pMG36e为载体 ,电击转化乳酸乳球菌 (L .lactis)NZ980 0进行表达。对表达产物性质的研究结果表明 ,3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化 ,其抑菌活性略有下降 ,但它们的稳定性表现各不相同 :N2 7K H31K的稳定性与NisinZ几乎一致 ,而T8S和T2S H31K的稳定性有明显提高 ,在pH9条件下10 0℃加热 5min仍不丧失抑菌活性。     

用蛋白质工程的方法改良枯草杆菌蛋白酶E(Subtilisin E)的抗氧化性

以含有蛋白酶E基因(aprE)的单链M13mp18-aprE DNA为模板,合成的寡核苷酸5′-3′为诱变引物,用缺口双链法对aprE进行Met-222-Ala点突变。经菌落印迹杂交筛选,选出阳性噬斑。用SaⅡ酶解M13mp18-aprE得到aprE,将它和pPZW103重组,转化中性、碱性蛋白酶缺失宿主菌DB104。经含卡那霉素和脱脂奶粉板筛选和比较aprE限制性内切酶NcoⅠ和SacⅡ水解电泳图谱分析,完成构建一个分泌抗氧化的枯草杆菌蛋白酶E的工程菌PW8888。     

枯草杆菌蛋白酶嗜热性改造单突变效果评判方法研究

对蛋白质进行嗜热性改造是蛋白质工程的主要问题之一,残基突变方法被广泛运用于其中。本文以枯草杆菌蛋白酶（SUBTILISIN BPN＇）为研究对象,旨在建立评判嗜热性改造效果的方法,选取了有可靠实验资料的9个突变点,运用分子动力学模拟方法,在四种不同模拟条件下,对其中的6个突变体和1个野生型蛋白进行了多种参量的对比分析,提取4个特征有效参量,建立了蛋白酶嗜热性改造单突变效果评判方法;利用该方法对其它3个突变效果进行评判,评判结果与实验资料完全吻合,证明该方法可用于枯草杆菌蛋白酶嗜热性改造单突变效果的评判。     

重组鱼腥藻脂肪氧合酶基因的克隆表达、分离纯化及活性分析

克隆鱼腥藻PCC7120基因组中脂肪氧合酶(ana-LOX)基因,对该功能基因进行了定点突变研究,确定了ana-LOX的最短功能基因长度,构建原核重组表达载体,对重组ana-LOX进行了分离纯化和性质研究。从GenBank中搜索到鱼腥藻PCC7120基因组中含有LOX基因,通过序列分析和比对,发现LOX功能基因位于双功能酶AOS(单加氧酶)-LOX的C端,通过定点突变研究,证实了ana-LOX活性中心位点为His197、His202、His369、Asn373和Ile455。通过逐步缩短基因长度的策略,获得ana-LOX基因的最短功能基因长度为1 254 bp。构建的表达载体pET-32a/ana-LOX转化入BL21(DE3)宿主内,在低温16℃条件下的诱导表达,重组脂肪氧合酶活力可达6 750 U/mL。表达产物通过Ni-NTA亲和柱进行分离纯化,比活达到11.4×104U/mg蛋白,酶活回收率为60.89%。重组ana-LOX最适反应温度45℃,最适反应pH 6.0,在常温下具有较好的稳定性,金属离子Fe2+、Mg2+、Ca2+对该酶存在明显的激活作用,而Fe3+和Cu2+对该酶有强烈的抑制作用。重组ana-LOX能够改善面团的显微结构。该研究获得了高效表达重组ana-LOX,为实现其在食品加工中的应用提供了参考。     

NisinZ的定点突变及突变体性质的研究

以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ201为模板,采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第8位Thr突变为Ser（T8S）、将第2位Dhb突变为Dha和第31位His突变为Lys（T2S/H31K）以及将第27位Asn突变为Lys和第31位His突变为Lys（N27K/H31K）,以pMG36e为载体,电击转化乳酸乳球菌（L.lactis）NZ9800进行表达。对表达产物性质的研究结果表明,3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化,其抑菌活性略有下降,但它们的稳定性表现各不相同：N27K/H31K的稳定性与NisinZ几乎一致,而T8S和T2S/H31K的稳定性有明显提高,在pH9条件下100℃加热5min仍不丧失抑菌活性。     

N13D、S40E点突变提高木聚糖酶XYNB的热稳定性

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。     

人乳头瘤病毒16型(新疆株)E7基因的克隆与突变研究

目的：克隆分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)新疆株的研基因;并对E7基因进行突变改造,以比较野生型与突变型HPV16E7基因的功能。方法：根据从中国新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取的DNA,进行PCR扩增获得HPV16E7基因,然后分别将其克隆到pMD18-T载体上进行DNA序列分析。根据HPV16E7基因的特点,分别设计点突变引物,用PCR的方法进行HPV16E7基因的点突变。结果：PCR检测显示扩增出HPV16(新疆株)E8基因;测序结果表明HPV16-XJ的研基因全长297bp,与德国标准株一致;利用设计突变位点的引物经PCR扩增,经序列测定后,分别得到了第70、172、271位碱基突变的HPV16E7基因;分别构建了野生型与单、双、三点突变的重组质粒pMD18-T-HPV16E7。结论：人乳头瘤病毒16型(新疆株)E7基因结构与德国标准株相同。HPV16E7基因多点突变的改造,为探索HPV16E7基因功能的变化和开展疫苗研究奠定了理论基础。     

Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶活性的影响

【背景】MIO(Methylidene-imidazol-5-one)依赖型酶中,催化因子Tyr所在Loop(Tyr78-loop)的灵活性显著影响酶学性质。【目的】探讨Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶酶活的影响,以提高其反应活性。【方法】将该酶的Tyr78-loop进行分子改造,筛选出酶活提高的突变体,并对突变体的酶学性质进行研究。【结果】突变体S73N、E95V、E95K和S73N/E95K在37°C、pH 8.5下比活分别比原酶提高了34%、30%、18%和35%。蛋白三维结构模拟推测在突变体S73N、E95V和E95K中,位于α螺旋与Tyr78-loop交界处的Asn73、Val95和Lys95与附近氨基酸的氢键作用力数目减少,一定程度上增加了Tyr78-loop的柔性。【结论】Ser73位和Glu95位氨基酸的突变增加了Tyr78-loop的灵活性,提高了苯丙氨酸脱氨酶的酶活。     

猪肺炎支原体P46基因的突变及序列分析

目的:将猪肺炎支原体P46基因中编码Trp的密码子TGA突变为TGG,为P46蛋白的研究及猪肺炎支原体抗体检测方法的建立奠定基础.方法:参考GenBank登录的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)P46基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成一对引物,对猪肺炎支原体强毒株F60 P46基因的编码区进行扩增,后又设计了三对突变引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对猪肺炎支原体P46基因的三个位点进行定点突变.结果:得到的序列与GenBank中登录的P46基因的核苷酸及氨基酸序列进行序列比较,结果表明它们有较高的同源性.突变后测序结果表明已成功将猪肺炎支原体P46基因中编码Trp的密码子TGA突变为TGG.结论:已成功突变Mhp P46基因并且序列比较显示其与其它序列同源性较高     

人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究

目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。     

枯草蛋白酶E的定点突变及其对酶性质的影响

用定点突变的方法研究S221C/P225A,N118S/S221C/P225A,D60N/S221C/P225A和Q103R/S221C/P225A突变对蛋白酶活性,酯酶活性与蛋白酶活性之比的影响。结果表明：S221C/P225A突变使蛋白酶活性比枯草蛋白酶E低73000多倍,酯酶活性与蛋白酶活性之比是Subtiligase的3倍;N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性和酯酶活性分别比S221C/P225A突变下降3.6倍和15倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降4倍,同时增加变体酶的热稳定性;D60N/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体下降15倍,但对酯酶活性几乎没有影响,酯酶与蛋白酶活性之比增加14倍,分别是S221C/P225A突变体和Subtiligase的3.3倍和10.3倍;但是,Q103R/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体增加5倍,酯酶活性下降55倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降1000倍。     

香蕉MaNHX5关键耐盐氨基酸位点的鉴定及验证

为提高香蕉NHX基因的耐盐性,从巴西蕉(Musa acuminata L. AAA group)中克隆到一个MaNHXs基因家族的MaNHX5基因,利用生物信息学方法预测了Ma NHX5关键耐盐氨基酸位点和突变前后蛋白质结构的变化,通过定点突变技术将Ma NHX5蛋白的276位丝氨酸(S)成功突变为天冬氨酸(D),利用AXT3盐敏感突变酵母进行功能回补试验。结果表明,将突变后的MaNHX5基因转入AXT3盐敏感突变酵母,200 mmol/L NaCl处理下,突变酵母耐盐性显著提高。由此推测Ma NHX5蛋白的Ser276对香蕉Na+跨液泡膜运输起重要作用。     

POLD1基因启动子中CDE/CHR元件的鉴定及功能分析

POLD1基因编码真核生物DNA聚合酶δ的催化亚基,其表达调控与细胞周期密切相关.为了探讨POLD1基因表达的调控机理,本研究首次在POLD1基因启动子中鉴定出CDE/CHR元件,随后通过分析元件序列定点突变对其转录活性的影响,以及与细胞周期相关的转录因子E2F和CDK及抑制因子p21WAF1/Cip1对其转录活性的调控作用,对此元件的功能进行了分析.结果显示,CDE/CHR元件序列突变后POLD1基因启动子转录活性明显升高,其转录活性不再受到E2F和p21WAF1/Cip1的调控,转录活性的细胞周期依赖性调控消失.与此同时本研究对直接参与CDE/CHR元件调控的蛋白进行了初步检测,结果显示,至少存在3种蛋白复合体能够与POLD1基因启动子中的CDE/CHR元件结合.由此证实,POLD1基因启动子中存在CDE/CHR元件,此元件与POLD1基因转录的细胞周期依赖性调控直接相关.     

P48L和D74N突变对p16基因功能的影响

应用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术,对p16抑癌基因(CDKN2)进行体外定点突变,在p16cDNA中引入第48位密码子CCG(Pro)→CTG(Leu)和第74位密码子GAC(Asp)→AAC(Asn)突变,构建了p16-P48L和p16-D74N突变体。野生型和突变型p16 cDNA克隆于pcDNA3构建pCMV-p16、pCMV-p16P48L和pCMV-p16D74N真核表达载体,导入纯合缺失p16基因的人肺癌细胞株H460,经RNA点杂交、RNA印迹和细胞免疫化学染色,检测到P16表达。通过比较表达野生型和突变型P16的H460细胞在~3H-TdR掺入及细胞所在周期的差异,证实P16表达抑制细胞进入S期,而P48L和D74N突变体对细胞进入S期没有什么影响,提示P48L和D74N突变导致P16蛋白功能丧失。     

生理pH条件下精氨酸脱亚胺酶的分子改造研究

精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase,EC 3.5.3.6,ADI）因其可作为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的靶向治疗药物而受到广泛关注. 目前,支原体来源的重组ADI处于肝癌和黑素瘤的三期临床研究阶段. 作为药用酶,当前报道的ADI在体内生理条件下普遍存在酶活低、半衰期短、底物亲和性弱等局限性.本研究结合随机突变及基于理性设计的定点突变两种方法,对研究室前期自主筛选得到的变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida来源的ADI经一轮定向进化后所获优势突变株M314(A128T/H404R/I410L)进行分子改造.通过对随机突变法获得的1480个突变株进行96孔板高通量筛选,得到优良突变株M173(A128T/H404R/I410L/K272R);同时,基于同源序列比对及ADI蛋白三维结构同源建模,采用PyMOL软件理性预测和分析其活性中心及附近保守区域氨基酸位点对蛋白功能的影响,选择了6个位点D78E、L223I、P230I、S245D、A275N、R400M分别在M314的基础上进行定点突变,最终获得优势突变株M04(A128T/H404R/I410L/S245D). 通过对突变株的酶学性质以及动力学参数分析发现：生理pH值下,突变株M173的酶比活（12.32 U/mg）在M314（9.02 U/mg）的基础上提升3659%,Kcat/Km提高5236%;而突变株M04的最适pH由6.5升高至7.0,更接近体内生理pH,其比酶活（14.66 U/mg）较M314提升62.53 %,Kcat/Km提高了37.12%. 综上结果,本研究结合两种分子改造方法成功地对该ADI在生理pH条件下的酶活和酶学性质进行了改良,并为蛋白质的分子改造策略提供了理论基础和实验依据.