hvmyb,一个GAmyb同源cDNA的克隆、序列分析和表达行为

利用已发表的GAmyb序列作探针 ,筛选大麦糊粉层cDNA文库 ,得到 2个序列完全相同的阳性克隆 .序列分析发现这 2个cDNA的 5′端与GAmyb基因的 3′端有 97%的同源性 ,其 3′端与任何myb基因都没有同源性 ,所以其开放读码框编码的产物事实上拥有完整的GAmyb转录激活区 ,但没有常规的DNA结合区 ,它很可能是一个新的基因 ,被命名为hvmyb (Hordeumvulgare,myb -homologous) .Northernblot分析表明 ,在大麦糊粉层中 ,hvmyb受赤霉素 (GA)诱导后大量表达 ,并且受脱落酸 (ABA)的抑制 .研究还发现hvmyb的表达具有时空特异性 ,它只在大麦糊粉层中得到表达 ,种子发芽后该基因就不再表达 ,幼苗中检测不到hvmyb基因活性 .     

苜蓿根瘤菌的正调节蛋白SyrM与nodD3基因P1上游区结合的位点及特性

在苜蓿根瘤菌中 ,nodD3分别由 2个启动子P1和P2在不同条件下介导表达 .通过凝胶滞后技术进一步研究与nodD3基因P1介导表达有关的反式作用因子 ,证明SyrM能与P1上游区结合 ,而NodD3则不能 ,因而排除了NodD3直接自身激活的可能性 .利用DNA酶Ⅰ足印分析确定了SyrM结合于nodD3基因P1上游区的顺式因子序列 ,在该序列中含有 2个顺向重复的反转重复结构 .通过合成的只含有 1个反转重复结构的 3种寡核苷酸片段与SyrM进行结合分析 ,结果表明SyrM不能与它们结合 ,因此SyrM可能是以二聚体或四聚体的形式与该顺式因子结合     

从真菌全基因组中筛选丛赤壳科的DNA条形码

将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的注释基因分别与30 种丝状子囊菌基因组比较, 根据E值大小预测同源序列, 从中选择Hsp90, AAC, CDC48和EF3作为候选基因, 以丛赤壳科(Nectriaceae)13 个属34 个概念清晰的种为材料, 对215个序列片段采用不同方法进行分析, 筛选适合于该科的DNA 条形码. 将种内与种间序列差异以及序列获得的难易程度作为评价指标. 结果表明,Hsp90 和AAC基因虽然具有较高的 PCR 扩增与测序成功率, 但种内、种间距离频率分布存在重叠, 可能导致部分种的鉴定错误;CDC48基因可以恰当地区分种内与种间差异, 但扩增与测序成功率相对较低; EF3基因不存在种内、种间遗传距离重叠, 序列容易获得, 适合作为该科真菌的DNA 条形码.     

野生中国大鲵Sox基因的克隆与序列分析

Sox基因家族是一类编码转录因子的基因家族,其产物具有一个HMG-box基序保守区,调节动物的性别决定与分化过程,并参与多种器官的发育。参照人SRY基因HMG-box保守区序列及有关文献,设计一对简并引物,PCR扩增了野生雌性中国大鲵（Andrias davidianus）基因组DNA,结果得到了一条长约220 bp的产物片段;菌落PCR扩增结果表明,克隆后的白色菌落中90%以上都是阳性克隆;通过SSCP技术筛选到3种有差异的阳性克隆,进行测序,获得了3个Sox基因：Sox4a、Sox4b与Sox14。对所得序列进行序列比对和聚类分析,结果显示该基因在分子进化上具有高度的保守性。对中国大鲵Sox基因的研究,目前国内外尚未见报道。为研究中国大鲵性别决定机制以及Sox基因进化提供了分子遗传学资料。     

豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析

从豌豆基因组中分离出一段具有核基质结合区(matrix attachment region,MAR)特征的DNA序列,与已知序列相比,获得的序列中部缺失了115bp的重复序列.重复序列上、下游两段序列与已知序列相对应的序列有较高的同源性,并具有A-box,T-box和TATAAA等典型的MAR序列特征.为验证此DNA序列的功能,以β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)作报导基因构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化了烟草.GUS定量检测表明,由于此DNA序列的存在,uidA基因的平均表达水平提高了2倍,最高的单株可达6倍.上述结果表明,该DNA具有MAR序列的特征序列,并且具有增加转基因表达的功能.     

核糖体蛋白质在翻译层次上调节λN基因表达的机理

报道大肠杆菌核糖体蛋白质S1 2或L2 4突变体均可以在翻译层次上抑制λN基因表达 .为研究其机理 ,用DNA外切酶Ⅲ(DNAExoⅢ)对λN lacZ融合基因上的λN基因部分进行了 5′→ 3′的缺失 ,以期改变λN基因的TIR(Translationalinitiationregion)或编码区 .经DNA序列分析共得到 2 3种缺失的λN lacZ融合基因 .比较它们在野生型菌株与核糖体蛋白质突变体内的β 半乳糖苷酶活性的结果表明 :( 1 )核糖体蛋白质S1 2突变体可以影响 30S小亚基同λN基因的TIR识别与结合 ,从而不利于 30S起始复合物形成 ,降低了翻译起始效率 ;( 2 )λN基因的编码区也是造成它在S1 2突变体内表达下降的原因 ;( 3)核糖体蛋白质L2 4突变体抑制λN基因表达的原因与翻译起始和λN基因 5′端的编码区无关 ,而可能与其 3′端结构基因有关     

Sox8基因HMG盒区内含子剪接位点分析

Sox基因参与广泛的发育调控过程.为了确定Sox8基因HMG盒区内含子的大小及剪接位点,通过计算机分析本室克隆得到的泥鳅Sox8基因包括HMG盒区在内的一段基因组序列,推测在HMG盒区可能存在一个内含子,进一步通过RT-PCR方法,克隆泥鳅Sox8基因HMG盒区cDNA片段,与基因组序列比较分析,确认在泥鳅Sox8基因的HMG盒区存在一个内含子,并确定了该内含子的序列及剪切位点.同时,比较分析了人和泥鳅Sox8在HMG盒区的内含子的剪切位点.结果显示,Sox8基因HMG盒区内含子剪切位点在进化上是保守的。 Abstract:Sox genes have diverse roles in developing processes,it was inferred there may be one intron in the HMG box by analyzing the genomic DNA sequence of the paramisgurnus dabryanus Sox8 gene.RT-PCR was used to verify the intron and its splicing site.First strand of the cDNA reverse-transcribed from liver RNA was amplified using the primers flanking the HMG box.RT-PCR products were cloned into the pUC18 plasmid and sequenced.The eomparison between the cDNA and genomic DNA sequence revealed the splicing site of the intron existing in the HMG-box of the paramisgurnus dabryanus Sox8 gene.We also compared the splicing site of the intron in the HMG-box of Sox8 gene between paramisgurnus dabryanus and human.These results suggest that the splicing site in the HMG-box of Sox8 gene was conserved.     

异育银鲫GABAB受体1亚基cDNA部分序列的克隆及表达分析

为了确定γ-氨基丁酸B受体（gamma-aminobutyric acid B receptor,GABA_BR）基因在异育银鲫（Carassius auratus gibelio）不同组织中的表达,本实验分别对异育银鲫不同组织中GABA_BR1基因进行RT-PCR扩增,并进行了克隆和测序,在与GenBank基因库中已知GABA_BR1序列进行同源性比对的基础上采用邻接法构建系统发育树,并进一步分析其在异育银鲫不同组织内的表达水平。经克隆获得异育银鲫GABA_BR1基因CDS区序列383 bp,编码127个氨基酸。荧光定量PCR结果显示,GABA_BR1基因在异育银鲫脑、肝、肾、心、肠、鳔、鳃、肌、尾鳍、脾、卵巢、精巢组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平由高到低依次是：脑>尾鳍>精巢>心、肠、鳔>卵巢、脾、鳃、肌>肝、肾。本研究证实了GABA_BR1基因在异育银鲫各组织中表达的广泛性,且有明显的组织特异性。     

抗菌肽CM Ⅳ突变体基因在E.coli中融合表达的研究

根据家蚕抗菌肽CMⅣ的氨基酸序列,利用E.coli偏爱的密码子设计并合成其突变体DNA,克隆到融合表达载体pEZZ318中,在E.coli中进行融合表达,经亲和层析得到26mg/L的融合表达产物.用化学方法裂解该融合表达产物,得到了具有抗菌活性的突变体抗菌肽CMⅣ.     

家蝇抗菌肽基因的表达模式研究

本研究曾报道过家蝇生长过程中的3个基因attacin, defensin, cecropin的转录体. 通过运用实时定量PCR定量分析家蝇不同发育阶段和诱导后不同时间点的三龄幼虫mRNA水平, 结果显示3个基因在三龄幼虫和成虫期转录水平较高. 同时分析发现, 在诱导后mRNA水平显著增加, 3个抗菌肽基因在敏感菌诱导后转录水平相对诱导前分别有cecropin 805倍、attacin 1009倍、defensin 2500倍的增强. 结果提示, 家蝇抗菌肽基因的转录在不同发育阶段和诱导后的不同时期是有差异的.     

乌龟Sox基因的克隆及测序

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列,设计1对兼并引物,扩增了乌龟（Chinemys reevesii)的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序,结果在雌雄个体中均筛选出4个不同的Sox基因,无性别差异性;其DNA序列和编码的氨基酸序列与人相应的SOX基因的相似性分别为92%、91%、84%、92%和100%、93%、98%、98%,显示出高度的保守性。     

鲫Kaiso基因cDNA的克隆和表达分析

在爪蟾和斑马鱼中, Kaiso是一种在整个基因组范围内与甲基化CpG序列特异性结合的转录抑制因子, 在调控被甲基化基因表达的时间模式中起重要的作用。为深入研究DNA甲基化对我国重要养殖鱼类生殖和发育的影响, 我们克隆了鲫Kaiso基因的cDNA序列, 并对其时空表达模式进行了分析。该cDNA全长3145 bp, 5′-非翻译区132 bp, 3′-非翻译区1117 bp, 开放阅读框1896 bp, 编码631个氨基酸。鲫Kaiso蛋白与其他物种Kaiso蛋白的同源性分析表明, 与其他物种一样, 其 N端和C端分别有高保守性的BTB/POZ结构域和锌指结构域。整胚原位杂交结果显示, Kaiso mRNA在早期胚胎发育的各个时期均广泛表达, 信号均一, 但从尾芽期开始出现组织特异性表达差异。对不同发育阶段胚胎的实时定量PCR检测结果表明: 卵子中有高丰度的母源Kaiso mRNA存在; 在卵裂期至囊胚中期胚胎中Kaiso mRNA的丰度逐渐降低; 从囊胚中期至原肠早期都维持在最低水平状态; 原肠后期其表达水平又逐渐升高, 至尾芽期达到与未受精卵中相当的高水平后在器官发生期的整体水平又稍有下降。Kaiso mRNA丰度在胚胎发育早期的这种变化过程提示在卵裂期检测到的mRNA可能都是母源mRNA, 合子核Kaiso基因可能是在囊胚晚期后才开始转录。对成体不同组织的实时定量PCR检测结果表明Kaiso的表达存在明显的组织特异性差异, 在鲫肌肉、视网膜、心脏和脑中表达水平较高, 而在肾、胰、肝等器官中表达水平很低。Kaiso表达的时间和组织特异性提示其作为甲基化基因的转录抑制因子参与了胚胎和成体基因表达时空模式的调控。这些结果为进一步研究Kaiso和DNA甲基化修饰在鲫发育调控和遗传育种中的作用提供了基础资料。     

拟南芥AtMPK3启动子应答逆境信号的表达模式和必需区域分析

蛋白激酶AtMPK3参与MAPK级联途径, 在植物逆境信号转导中起重要作用. 为深入研究AtMPK3基因在转录水平上应答各种环境胁迫的分子机制, 本研究从拟南芥基因组中分离了AtMPK3基因转录起始位点上游1016 bp的启动子序列, 对其进行了生物信息学分析. 对该启动子进行了系列缺失突变, 并将完整启动子和缺失启动子片段与GUS报告基因融合, 转基因导入到拟南芥中. 携带AtMPK3启动子及其各种缺失突变体的转基因植株在干旱、高盐、低温、机械损伤等胁迫条件的GUS组织化学染色和荧光定量分析表明, AtMPK3启动子应答干旱、高盐、低温、机械损伤逆境信号的必需元件位于启动子序列中转录起始位点上游−188 ~ −62区域内, 揭示了AtMPK3启动子在不同环境胁迫条件下的表达模式的差异. 本研究结果有助于阐述AtMPK3基因在转录水平上应答不同胁迫信号分子机制.     

虎斑颈槽蛇Sox基因的克隆及测序

参照人SRY基因HMG-box保守区序列设计一对兼并引物,PCR扩增虎斑颈槽蛇的Sox基因,采用SSCP技术筛选阳性克隆,并对其进行了测序。结果表明：在雌雄个体中共筛选出3个Sox基因,其中一个为雄性独有,显示出性别差异性,3个Sox基因DNA序列及编码的氨基酸序列与人相应SOX3,SOX11,SOX22基因的相似性分别为91%,92%,91%和98%,96%,96%。显示出高度的保守性,实验结果为虎斑颈槽蛇的性别决定机制研究提供了分子资料。     

基于COⅢ和HNF-1α序列研究龟鳖类的系统进化特征

用PCR扩增和测序的方法,获得小鳄龟(Chelydra serpentina)的COⅢ和HNF-1α序列,并分别结合NCBI中其他龟鳖的同源性序列进行比对分析。比对后得到757 bp的COⅢ一致序列和769 bp的HNF-1α一致序列。其中,COⅢ一致序列含有可变位点324个,序列总变异率为42.8%,简约信息位点230个;T、C、A、G的平均含量分别为27.5%、26.6%、30.8%、15.1%,A+T含量(58.3%)高于G+C含量(41.7%),转换/颠换比率(R)为2.62。HNF-1α一致序列有变异位点112个,变异率为14.6%,简约信息位点67个;T、C、A、G的平均含量为26.1%、23.1%、28.3%、22.6%,A+T含量为54.4%,G+C含量为45.7%,转换/颠换比率(R)为1.42。基于Kimura双参数模型计算龟鳖类种间、属间、科间遗传距离,并采用邻接法、最大简约法和最大似然法构建分子系统进化树。结果显示:基于COⅢ序列的淡水龟科4个属间的遗传距离为0.090～0.153,平均遗传距离为0.129;曲颈龟亚目5个科之间的遗传距离为0.150～0.207,平均遗传距离为0.177;基于HNF-1α序列的龟科9属间的遗传距离为0.003～0.051,平均为0.016;鳄龟科、龟科、淡水龟科3科间的遗传距离为0.044～0.067,平均为0.053。由遗传距离和构建的系统进化树可知,淡水龟科与陆龟科具有较近的亲缘关系,而与龟科的亲缘关系较远;支持龟科重新划分为两个分支;鳄龟科和海龟科亲缘关系较近,大鳄龟(Macroclemys temminckii)和小鳄龟可能同为一属。     

中华绒螯蟹两个Sox基因HMG－box的克隆及测序

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列设计一对兼并引物,PCR扩增中华绒螯蟹的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果表明：在雌雄性个体中筛选出两个不同的Sox基因ESSox3和ESSox22,尽管中华绒螯蟹属甲壳类动物,但所测序列ESSox3和ESSox22的DNA序列和编码的氨基酸序列与人相应SOX基因的相似性分别为84%,85%和97%,81%,表明该基因在进化上具高度的保守性。本研究为探索中华绒螯蟹的性别决定机制以及Sox基因的进化提供了分子资料。     

扬子鳄4个Sox基因保守区的克隆及序列分析

参考人SRY基因HMG－box的保守区序列,设计一对简并引物,用PCR扩增了扬子鳄Sox基因的HMG－box,并对PCR产物进行了亚克隆和测序。结果在雌雄个体中均筛选到4个不同的Sox基因,无性别差异。其序列与人相应的SOX基因保守区编码序列的相似性分别为91％、96％、100％、96％,分别命名为AS－Sox1,ASSox2,ASSox11,ASSox22。与其他动物相关的Sox/SOX基因的聚类分析结果表明,扬子鳄Sox基因编码的氨基酸序列与进化位置各异的其他动物的Sox/SOX基因编码的氨基酸序列存在高度的同源性,显示出Sox基因在系统进化上的高度保守性。     

La-tPA/G-CSF双转基因鼠的建立及在乳腺的表达研究

分别以小鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′区 2 .6kb和羊β 乳球蛋白 (BLG)基因5′区 5kb为调控序列 ,构建了乳腺表达人集落剌激因子 (G -CSF)及组织纤溶酶原激活剂突变体 (La- tPA)载体 .利用显微注射法分别建立了G -CSF和La -tPA的转基因小鼠 ,在获得G -CSF和La -tPA表达基础上 ,采用 2种转基因小鼠交配的方式 ,对后代仔鼠进行了双引物同步PCR检测 ,筛选并建立了La- tPA和G -CSF的双转基因鼠 ,研究了不同转基因在小鼠体内共表达的情况 .Northernblot分析表明 ,在一些双转基因鼠中表达出La- tPA和G -CSF .后代鼠的一些基本特征为 ,产仔数明显低于正常鼠 ,双转基因占 46 .1 %,雌雄比例基本正常 .双转基因鼠的建立为未来利用转基因动物生产多种蛋白质提供依据 .     

BmCyclin B和BmCyclin B3是家蚕细胞周期进程所必需的

B型细胞周期蛋白(Cyclin B)是细胞G2期向M期转化的重要调节因子. 家蚕基因组数据分析表明, 家蚕有2个Cyclin B基因, 即BmCyclin B和BmCyclin B3. 利用家蚕EST数据, 成功克隆了家蚕Cyclin B3基因(EU074796), 该基因全长1665 bp, ORF长1536 bp, 由6个内含子和7个外显子构成, 编码511个氨基酸, 含有1个蛋白破坏盒和2个周期蛋白盒, 预测分子量57.8 kD. 家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的BmCyclin B和BmCyclin B3基因RNA干涉结果表明, BmCyclin B和BmCyclin B3是家蚕细胞完成细胞周期进程所必需的, 二者干涉后均能导致细胞周期阻滞于G2/M期, 抑制细胞的增殖.     

鲤鱼中Sox9b基因的克隆和表达

Sox9基因是一个重要的转录调控因子,参与性别决定及软骨等多种组织和器官的发育过程。本研究利用简并引物扩增鲤鱼基因组DNA,首次发现在鲤鱼中存在两种形式的Sox9基因。二者在保守盒区编码的氨基酸序列相同,并都存在一个内含子,但内含子序列差异很大,分别长704bp和616bp。在此基础上采用RACE技术克隆了鲤鱼Sox9b基因的5’端和3’端,通过拼接获得了2447bp 的全长cDNA序列,编码428个氨基酸。其中96-174位共79个氨基酸为HMG保守盒。将鲤鱼Sox9b基因与三刺鱼等九种动物的氨基酸序列相比较发现,它们的同源性高达75%以上,显示Sox9 基因在进化中较保守。应用半定量RT-PCR技术对成体鲤鱼不同组织中Sox9b基因的表达进行了分析,结果表明该基因广泛表达,尤以脑及精巢中表达最为丰富。