绿色荧光蛋白及其应用

许多海洋无脊椎动物体内都含有绿色荧光蛋白,这种蛋白质结构很特殊,在受到激发时可以发射绿色或蓝色荧光。本文将就绿色荧光蛋白的结构,性质及其应用前景作一综述。     

绿色荧光蛋白的特性及其在信号转导中的应用

细胞和分子生物学的最终目标是 ,明确细胞内的各种事件是如何发生的 ,明了细胞内复杂的动态变化的生化机制。绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ)自从克隆、表达之后 ,以其良好的物理特性及荧光特性而成为良好的报告基因和荧光标记分子 ,并在探索生命现象过程中得到了非常广泛的应用。ＧＦＰ作为报告基因 ,可用在活细胞中直接观察蛋白质向细胞器 ,如细胞核、内质网中运动 ;作为荧光标记分子 ,ＧＦＰ既具有敏感的标记检测率 ,又没有放射性的危害 ;最近又发现ＧＦＰ是一个良好的细胞间信号传递的动态标记…     

绿色荧光蛋白及其应用

许多海洋无脊椎动物体内都含有绿色荧光蛋白,这种蛋白质结构很特殊,在受到激发时可以发射绿色或蓝色荧光。虽然对它的研究从本世纪六十年代才开始,但是它独特的性质逐渐引起了生物学界的广泛关注。本文将就绿色荧光蛋白的结构、性质及其应用前景作一综述。     

绿色荧光蛋白及其在植物研究中的应用

绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(Aequorea victoria)体内的一种发光蛋白,分子量27kD,由238个氨基酸组成。该蛋白65~67位Ser-Tyr-Gly三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构。野生型GFP发光较弱,而且gfp-cDNA含有隐蔽型剪切位点,而加工改造的GFP在植物中能够正常表达并且加强了荧光信号。GFP作为新的报告基因和遗传标记被广泛应用于植物研究之中。     

绿色荧光蛋白及其在植物研究中的应用

绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）是海洋生物水母（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）体内的一种发光蛋白,分子量２７ｋＤ,由２３８个氨基酸组成。该蛋白６５～６７位ＳｅｒＴｙｒＧｌｙ三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构。野生型ＧＦＰ发光较弱,而且ｇｆｐｃＤＮＡ含有隐蔽型剪切位点,而加工改造的ＧＦＰ在植物中能够正常表达并且加强了荧光信号。ＧＦＰ作为新的报告基因和遗传标记被广泛应用于植物研究之中。     

绿色荧光蛋白及其应用

随着对绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)研究的不断深入,人们对其结构、荧光产生机理等已有较为全面的认识。近年来利用GFP及其它荧光蛋白(FPs)发展了诸如荧光互补技术(FC)、荧光共振能量转移技术(FRET)和超分辨成像(super-resolution imaging)等一系列新技术,极大地促进了生物学、医药科学的研究。主要介绍了荧光蛋白的结构,荧光产生的机理,不同类型的荧光蛋白和基于荧光蛋白产生的新技术等方面的最新研究进展。     

呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的表达差异研究

目的构建呼吸道合胞病毒融合蛋白F1和截短F1蛋白的原核表达载体,并对它们在大肠杆菌中的表达差异进行了初步研究。方法用DNAstar软件对呼吸道合胞病毒F1蛋白进行亲疏水性和抗原表位可能性分析后,将其两端的疏水区域截去之后与pET-42b(+)构建表达载体,同时用相同的表达系统构建F1蛋白的表达载体并将2种重组蛋白进行诱导表达。实验对2种蛋白在Rossata/pET-42b(+)菌株中的表达难易度、表达形式及初步洗涤的包涵体纯度进行了比较。结果与F1蛋白相比,截短的F1蛋白相对更容易表达,表达的可溶性蛋白含量更高,洗涤纯化后的包涵体纯度也更高。结论呼吸道合胞病毒F1蛋白截去两端疏水氨基酸后更容易表达,为后期蛋白的大量制备及其免疫原性研究奠定了基础。     

c-Myb截短突变体的构建及其对c-Myc蛋白表达的调节

目的:为了研究c-Myb蛋白各结构域的功能,构建c-Myb的6种截短突变体c-Myb-1~c-Myb-6的真核表达载体,测定不同突变体对c-Myc蛋白表达的影响。方法:以野生型c-Myb为模板,PCR扩增c-Myb-1~c-Myb-6片段,分别克隆到pcDNA3.0-FLAG载体,Western印迹检测克隆载体在293T细胞内的表达;将上述载体与野生型c-Myb转染乳腺癌细胞株MCF-7,检测其对c-Myb下游基因c-Myc表达的影响。结果:构建了c-Myb-1~c-Myb-6表达载体,与野生型c-Myb相比,c-Myb-1、c-Myb-4、c-Myb-5均能够促进MCF-7细胞中c-Myc的表达,而c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-6则不能。结论:该研究为进一步探讨c-Myb在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

截短绿色荧光蛋白突变体反式剪接修复核酶

Ⅰ型内含子核酶经过设计特定的信号引导序列（IGS）,可特异性地定点剪接目的基因RNA,从而在RNA水平达到修复病变基因的目的。以四膜虫材料,克隆了其26S rRNA内含子核酶基因,体外转录证实该I型内含子核酶具有完全的自我剪接的功能。为检测该核酶的反式剪接功能,构建了缺失后半段564bp基因序列的绿色荧光蛋白（GFP）的截短突变体重组质粒XYQ5/XYQ10pEGFP-C-2,并证实其失去了发射绿色荧光的活性。利用PCR和分子克隆技术,构建了以上EGFP突变体的反式剪接修复核酶ptrans-rib-CMV2,该核酶载体以克隆的26S RNA内含子为核心,选择EGFP编码区194位TG为剪接位点,以188-193位设计IGS序列,核酶3′端携带195-890bp的EGFP基因序列,连接于pRC-CMV2真核表达载体中。体外转录突变EGFP的原核表达载体XYQ5/10-pGEM和ptrans-rib-CMV₂,以混合转录产物为模板进行RT-PCR,电泳及测序证实产物中含有反式剪接修复的野生型EGFP mRNA,从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能。将截短突变重组质粒XYQ5/XYQ10- pEGFP-C₂与核酶质粒ptrans-rib-CMV₂共转染Hela细胞,用荧光显微镜观察转染结果,发现有少量共转染的Hela细胞发出绿光;RT-PCR检测出野生型EGFP mRNA,证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能,但其反式剪接效率低。     

绿色荧光蛋白与 HCV 核心蛋白的融合及在大肠杆菌中的高效表达

利用基因工程重组技术获得了绿色荧光蛋白（ｇｆｐ）基因与ＨＣＶ核心蛋白（ｃｏｒｅ）基因的嵌合体,并在大肠杆菌中高效表达了４８ｋＤａ的融合蛋白,经ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫活性分析证实,融合蛋白仍具有ｃｏｒｅ抗原的三个免疫活性部位,同时用荧光显微镜观察并用荧光光度计测定了大肠杆菌表达的融合蛋白的荧光光谱,结果证实,我们在大肠杆菌中表达的ＧＦＰｃｏｒｅ融合蛋白既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＣＶ核心蛋白的抗原活性,实现了用绿色荧光蛋白等分子标记抗原,为免疫诊断新方法的建立,打下了理论基础。     

四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定

将来源于水母的绿色荧光蛋白基因 (gfp)和来源于E .coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因 (tetR)共同构建到E .coli表达载体pET_30a +上 ,获得TetRC_端与GFPN_端融合蛋白。对经诱导表达并纯化后的融合蛋白 (TR∷GFP)进行荧光发射光谱分析表明 ,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性 ,即在 395nm激发下 ,可在 5 10nm附近有特征发射峰。在加入四环素后 ,融合蛋白在 395nm激发下 ,在400nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化 ,荧光强度普遍增加 ,且以 510nm处最大发射峰增幅最大 ,由原来 1132增至 2214 ,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大 ,结果表明该融合蛋白 ,能感受外界四环素 ,并产生一定的荧光变化。     

用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HBVe抗原

通过基因工程操作,使乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）基因与绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ）融合,用新型Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ＨＢｅＡｇ－ＧＦＰ双功能融合蛋白。经ＥＬＩＳＡ法和荧光显微镜观察证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＢＶ的ｅ抗原活性,为免疫诊断新方法的建立进行了有益的探索。     

HCMV截短UL83基因真核表达重组体的构建、转染及其免疫效力研究

为了构建人巨细胞病毒(HCMV)截短UL83基因真核表达重组体,实现其在Hep-2细胞中的稳定表达,研究该截短UL83基因真核表达重组体免疫效力,采用基因重组的方法,将HCMV AD169株截短UL83基因定向克隆到带有绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上,构建真核重组表达质粒pEGFP-C1-UL83;脂质体转染至Hep-2细胞中,G418筛选获得稳定表达pp65细胞表达系。经基因测序显示,重组体中截短UL83基因完全正确,RT-PCR和Western blot检测证实其可在Hep-2细胞中稳定表达。用该重组体和其表达产物在HCMV先天性感染小鼠模型上进行免疫保护试验显示,母鼠血清可检测到特异性抗HCMV pp65抗体,效价为:1∶2.51~1∶50.79;子鼠脑组织内未分离出病毒,亦未检测出病毒pp65蛋白抗原表达。初步结果表明,pEGFP-C1-UL83具有较好的免疫原性,可作为DNA疫苗刺激机体产生有效抗体,并具有阻止病毒垂直传播的保护性作用。     

乙型肝炎病毒e抗原基因与绿色荧光蛋白基因的融合及其表达

质粒pS65T含有T7启动子驱动的绿色荧光蛋白突变型gfpS65T基因,经修饰后,在其中插入乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）基因,使两基因同框成为融合基因。在大肠杆菌BL21中由于T7启动子的控制,高效表达了具有双功能（抗原性和发光性）的融合蛋白（GFP－HBeAg）。融合蛋白MW为52kDa,N端有6个组氨酸残基,因而用Ni金属螯合层析柱对融合蛋白进行了分离纯化,利用诊断HBV的ELISA试剂盒检测了融合蛋白的抗原性,在荧光显微镜下观察到了融合蛋白的绿色荧光。并探讨了用其组装成新型免疫诊断试剂的可能性。     

绿色荧光蛋白与Wee1 Hu融合基因的构建及其真核表达

 构建Wee1Hu与增强型绿色荧光蛋白 (GFP)融合基因表达载体 ,并对其在真核细胞的表达及生物学效应进行研究 .应用基因工程技术构建重组载体 ,脂质体转染胰岛 β细胞株 ,流式细胞仪和免疫沉淀 Western印迹检测融合蛋白的表达 ,共聚焦显微镜分析融合蛋白在活细胞内的分布 ,3 D结构模建分析其结构特点 ,并用MTT法检测其生物学活性 .结果显示融合基因在瞬时或稳定转染的真核细胞中均获表达 ,融合蛋白主要分布在胞核区 ,融合蛋白中Wee1Hu的空间构象与天然Wee1Hu完全相同 ,表达融合蛋白的胰岛β细胞可避免其被细胞毒T淋巴细胞 (CTL)杀伤 .结果表明GFP Wee1Hu融合蛋白中 ,可发绿色荧光的分子标签GFP未能影响Wee1Hu的结构及其生物学活性 ;Wee1Hu可通过调控细胞周期而阻断CTL介导的细胞凋亡     

表达绿色荧光蛋白突变体的重组伪狂犬病毒的构建及其增殖特性

将绿色荧光蛋白突变体M 1(EGFPS14 7/P)基因融合到伪狂犬病毒 (PRV)非必需糖蛋白 gG的第 8个氨基酸下游 ,通过同源重组、空斑纯化和PCR筛选获得能表达M 1并导致gG基因部分缺失的重组病毒 gG-/M1 。重组病毒经Southern杂交、Western印迹和荧光观察证实构建正确。纯化的重组病毒以低感染指数接种PK 15细胞 ,在感染早期 (6h)就能观察到荧光 ,随着病毒的增殖 ,荧光逐渐增强 (2 4～ 36h) ,直至完全病变 ,荧光淬灭。进一步对重组病毒gG-/M1 与亲本株gG-/LacZ 、野毒株的增殖特性进行比较 ,发现 3种毒株在增殖滴度上无显著差异。上述结果表明构建的PRVgG-/M1 突变株能作为活细胞示踪实时监测病毒感染的动态分析。     

蛋白质截短检测在基因突变在检测中的应用

蛋白质截短检测（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＰＴＴ）是从蛋白质水平对基因突变进行检测的方法。由于ＰＴＴ具有与以往广泛使用的方法不同的独特优点，自１９９３年发明以来，先后在ＡＰＣ、ＤＭＤ、ＢＲＣＡ１、错配修复基因（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ）突变检测中得以应用。     

绿色荧光蛋白在转基因研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)是一种能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光的蛋白。有现代生物学北斗星之美誉的它,在生物学的很多领域都有广泛应用。GFP具有荧光稳定、易于检测、表达调控简单、生物安全性好等优点,在转基因研究中的各个方面均应用颇多。就GFP在转基因研究中的应用特点及应用进展做一综述。     

Mpl与绿色荧光蛋白融合基因的真核载体构建及表达

目的:探索Mpl与绿色荧光蛋白GFP基因共同转粢哺乳动物细胞NIH3T3的方法.方法:采用PCR方法将GFP基因与Mpl基因构建融合荧光蛋白的真核表达载体,用脂质体介导转染NIH3T3细胞和筛选稳定细胞系,使用荧光显微镜方法和Westernblotting检测转染效果.结果:利用PCR方法有效扩增了Mpl基因,构建了融合荧光蛋白的真核表达载体,序列分析表明所构建的含Mpl基因的质粒与设计相同,使用荧光显微镜方法和Western blotting检测Mpl融合绿色荧光蛋白表达载体成功转染NIH3T3细胞.结论:成功构建了Mpl荧光表达载体,融合基因可以在NIH3T3细胞中稳定表达,为进一步研究Mpl的生物学活性及其与hNUDC蛋白相互作用提供了重要的理论依据.     

绿色荧光蛋白基因研究进展

绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）基因是目前唯一在细胞内稳定表达,不需要任何反应底物及其它辅助因子,无种属,组织和位置特异性,其产物ＧＦＰ对细胞无毒性,且检测简单,结果真实可靠的新型报告基因,其特有的生物化学性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。