江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2正交晶型Ⅰ——0.25nm分辨率晶体结构

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A₂ 具有强烈的溶血及抗凝血活性 .运用刚体修正技术获得了正交晶型Ⅰ中分子的精确旋转与平移参数 .采用非晶体学二重对称性制约的最小二乘修正方法在 0 .6～ 0 .2 5nm分辨率范围内进行了结构精化 .最终的晶体学R因子为 2 0 .1 % ,键长、键角与标准值的均方根偏差分别为 0 .0 0 1 3nm和 1 .5 5° .与正交晶型Ⅱ结构比较表明 ,二者除了β -折叠部位与Ca ²⁺结合部位构象存在小的差别外 ,磷脂酶A₂分子主体构象极其相似 .2种晶型由不对称单位中 2个分子形成的二体也是类似的 .但是 ,二体中 1个单体分子的相对取向有 5 .5°的差别 ,提示二体结合面有一定柔性 .晶型Ⅰ二体较晶型Ⅱ二体在晶胞中的堆积更紧密 .     

江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A2晶体的非晶体学对称性研究

用悬滴气相扩散法获得了突触前神经毒素中性磷脂酶A₂的晶体,空间群为P2₁,并有明显的C2赝对称性.晶胞参数为a=10.836nm,b=8.486nm,c=7.082nm,β=109.87°在Siemens X-200B面探测器上收集了0.26nm分辨率的衍射数据.赝C2对称性揭示存在一个平行于晶体学b轴方向的非晶体学二重对称轴.采用POLARRFN程序进行分子置换法的自身旋转函数计算,在不同积分半径和分辨率范围均得到了稳定且相对突出的4个峰,对应3个一般方向的非晶体学二重对称轴和1个特殊的非晶体学对称关系.从它们之间的相互关系推测晶胞内多个分子的堆积情况:分子可能以二体形式存在,并以“二体的二体”方式排列.     

B链C端去七肽(B24～B30)胰岛素的分子置换法

一个几近失活的胰岛素类似物———B链C端去七肽 (B2 4～B30 )胰岛素(DHPI)已被结晶 .该晶体属于空间群P2 ₁2 ₁2 ₁,晶胞的 1个独立区内包含有 2个DHPI分子 .应用分子置换法确定了DHPI分子在晶胞中的取向和位置 ,并在 0 .3nm分辨率水平上构建了结构模型 .研究结果表明 ,一个独立区内的 2个DHPI单体分子由一个非晶体学 2次轴联系着 ,该局部 2次轴近似平行于晶体学c轴 .这一特性直接影响了自身旋转函数对该局部对称轴取向的确定     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A₂（A.aBPLA₂）基因克隆至温敏表达载体pBLMVL2,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达.表达产物A.aBPLA₂约占细菌蛋白质总量的20％,并以包涵体的形式存在.纯化包涵体后,将产物变性、复性,然后用FPLC Superose^TM12纯化,产物经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带.对纯化后的表达A.aBPLA₂进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定.结果显示,表达A.aBPLA₂的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A₂酶活性相近,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A₂的溶血活性,没有抑制血小板聚集活性.最后对磷脂酶A₂的结构与这些活性的关系进行了讨论.     

来源于Eisenia fetida的蚯蚓纤溶酶组分A的多对同晶置换法相位求解

来源于Eisenia fetida的蚯蚓纤溶酶组分A, 既是直接的纤溶酶, 又是纤溶酶原激活物的蛋白质, 已经被结晶. 晶体属于正交晶系, 空间群为P2₁2₁2₁, 每一个不对称单位含有3个蛋白质分子. 为了解析该蛋白质的衍射相位, 使用含有1.4 mol/L Li₂SO₄, 0.1 mol/L MOPS(pH 7.2)的重原子浸泡母液制备了4种合用的重原子衍生物. 用差值Patterson法和差值Fourier法确定了衍生物晶体中重原子的位置, 并将其联合修正获得0.25 nm分辨率的初始蛋白质结构相位. 通过重原子位置关系确定了不对称单位中3个独立蛋白质分子之间的非晶体学对称关系, 并利用其对初始的电子密度进行平均, 大大提高了电子密度质量, 为进一步的结构解析奠定了基础.     

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2正交晶型Ⅰ--0.25nm分辨率晶体结构

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2具有强烈的溶血及抗凝血活性.运用刚体修正技术获得了正交晶型Ⅰ中分子的精确旋转与平移参数.采用非晶体学二重对称性制约的最小二乘修正方法在0.6～0.25 nm分辨率范围内进行了结构精化.最终的晶体学R因子为20.1%, 键长、键角与标准值的均方根偏差分别为0.0013 nm和1.55°.与正交晶型Ⅱ结构比较表明,二者除了β-折叠部位与Ca2+结合部位构象存在小的差别外,磷脂酶A2分子主体构象极其相似.2种晶型由不对称单位中2个分子形成的二体也是类似的.但是,二体中1个单体分子的相对取向有5.5°的差别,提示二体结合面有一定柔性.晶型Ⅰ二体较晶型Ⅱ二体在晶胞中的堆积更紧密.     

江浙蝮蛇毒性碱性磷脂酶A2新单斜晶型晶体结构测定

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2具有溶血和抗凝血活性。在不含正辛基吡喃葡萄糖苷（n-octyl β-o-glucopyranoside,简称β－OG）结晶条件下,培养出该酶新单斜晶型晶体。采用X射线晶体学方法,成功地解出了不对称单位含4个分子的新单晶型结构。在分子置换研究中心运用自身与交叉旋转函数的联合分析,在结构修正中使用非晶体学对称性制约,最终结构模型具有可接受的晶体学R因子和合理的立体化学参数。与已报道的结合β－OG的单斜晶型结构类似。新晶型中分子也形成具有二重对称性的、被界面识别部位连接的二体,两个二体再通过非晶体学二重轴联系形成一个赝222对称的四聚体。 结晶条件改变对四体在晶胞中的堆砌产生重要影响,导致晶胞参数的显著变化,然而对二体和四体本身影响较小,表明单斜晶型中观察到的二体与四体是稳定的。     

福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的晶体生长和初步晶体学研究

过氧化物酶是一类广泛存在于生物体内的抗氧化剂,清除有氧代谢过程中产生的活性氧,对于保护机体内的生物大分子有重要的生物学功能。福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶(SF2523)作为过氧化物酶家族的一员,通过清除福氏志贺菌体内的活性氧,在维持其活性和致病性上起重要作用。目前,SF2523的三维结构还没有得到解析,其具体的功能机制也尚不清楚。为了得到SF2523蛋白的三维结构,进而了解具体的功能机制,实验获得均一稳定的可溶蛋白,验证具有体外活性,培养出可用于X射线衍射的蛋白质晶体。在中国科学院高能物理研究所同步辐射收到晶体的衍射数据供结构解析使用。SF2523晶体的属于空间群P2₁2₁2₁,晶胞参数为a = 35.80 ?, b = 50.63 ?, c = 88.52 ?, α = β = γ = 90.00°,每个晶体学不对称单位含有1个蛋白质分子,马修斯系数为2.03 ?₃ /u,溶剂含量为39.56%。     

P.versicolor龙虾D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶的X射线晶体学研究——分子置换法结构测定

由P.versicolor龙虾尾肌提取的HOIO-D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),已长出可供Χ射线衍射用的晶体。初步Χ射线晶体学研究确定:此酶晶体属於C2空间群,不对称单位内含有半个分子,分子坐落在二重轴上。以Homarus Amercanus龙虾GAPDH结构为模型结构,应用分子置换技术进行了低分辨率Χ射线结构分析,结果表明:分子内亚基排列具有222对称性,分子Q轴平行于晶体学二重轴b,分子P和R轴分别平行于晶体学a和c轴。按分子置换法推出的结构模型算得5A分辨率的晶体学R因子为0.46。并获得了一套5A。分辨率的电子密度图。此酶的几种同晶型晶体,特别是荧光NAD衍生物晶体的较高分辨率的结构分析工作正在进行中。     

鸡肝果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域的初步晶体学研究

从鸡肝6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶分离的果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域(残基245～468)已在E.coli中获得高效表达,并经分离得到纯化,使用悬滴气相扩散法成功地培养出该果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域单晶.该酶晶体属于四方晶系,空间群为P4₁2₁2或P4₃2₁2,晶胞参数为:a=b=10.02nm,c=13.98nm,α=β=γ=90°.晶胞内每个结晶学不对称单位含有2个果糖-2,6-二磷酸酯酶分子.利用日本 Photon Factory同步辐射光源收集了分辨率为 0.32 nm的母体衍射据.     

人分泌型磷脂酶A2-IIA的功能性动力学特征研究

目的 人分泌型磷脂酶A₂-IIA（secretory phospholipase A₂ group IIA,sPLA₂-IIA）在调节细胞脂质代谢和信号传导中具有重要作用,参与了多种急、慢性炎症反应。研究其动力学和变构与功能的关系具有重要意义。方法 利用弹性网络模型（elastic network model,ENM）、微扰响应扫描（perturbation-response scanning,PRS）和蛋白质结构网络（protein structure network,PSN）方法对来自人sPLA₂-IIA的31个分子的结构动力学和变构效应进行分析,并探索其动力学共性和特异性与功能的关系。结果 结果表明,对酶的催化和结构稳定起关键作用的催化残基和参与二硫键形成的半胱氨酸残基具有低运动性,这是对酶共有功能的要求;而涉及与钙离子或膜结合的5个结构区域具有高运动性,它们体现了酶成员的特异性。另外,高运动性区域在PRS分析中显示出对外界微扰响应的高敏感性,表明其在变构调节中起重要作用,而低敏感性残基则在维持结构稳定方面发挥了重要作用。残基运动相关性分析发现,人sPLA₂分子催化位点周围的强相关运动有利于酶催化功能的发挥。结论 本研究有助于深入理解人sPLA₂-IIA成员分子的动力学及功能性变构机制,可为药物设计和准确设计具有精细调节活性的蛋白质提供指导。     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A2的新晶型结构

从尖吻蝮蛇毒中分离出一种酸性磷脂酶A2 ,得到了一种新的晶型。用分子置换法测定其晶体结构 ,结构的分辨率达到 0 .2 8nm。该结构给出 2 1.9%的晶体学R因子 (R free =2 5 .7% )和合理的立体化学参数。与已报道的晶型相似 ,不对称单元的两个独立分子形成二体 ,揭示了这种二体的稳定性。二体的形成过程也伴随着 14～ 2 3肽段显著的构象变化 ,这一肽段属于磷脂酶A2 的界面识别部位。氨基酸序列分析表明 ,带正电荷的 34位残基是所有第二类具有溶血活性磷脂酶A2 的共同特点。NaCl对晶体的堆积具有显著的影响 ,从而导致晶胞参数的明显改变。与已报道的晶型不同 ,在酶分子的疏水通道内观测到了 2 甲基 2 ,4戊二醇 (2 methyl 2 ,4 pentanediol,MPD)分子     

蛋白质和磷脂酶A2等电点的理论预测

应用计算数学方法计算了胰岛素等9种蛋白质的等电点,结果表明计算值同实验测定值比较吻合,二者间的差异不显著(P＞0.05).同时还预测了49种磷脂酶A₂的等电点.这一预测结果不仅对这类酶的分离纯化有一定参考价值,也有助于了解磷脂酶A₂同功酶的性质.     

用ESR方法研究光敏作用的动态过程

通过动力学方法建立了光敏作用中¹O₂被TEMPONE捕捉产生的TAN自由基对时间的函数关系式,据此可求出光敏作用Ⅰ,Ⅱ型机制产生各种活性中间体的相对速率常数.并应用上述公式,结合实验结果,具体求算了3种无酵类光敏剂HA,HB,CP在DMF-H₂O和DMSO-H₂O体系中产生¹O₂,O₂和PS的相对速率常数,进而探讨了苝醒光敏剂的构效关系和光敏机制与溶剂的关系.     

大肠杆菌tRNALeu的基因克隆、高效表达和纯化

用化学法合成的tRNA^Leu 和tRNA^Leu ₂的基因分别连接到 pTrc99B质粒载体上 ,转化到大肠杆菌MT10 2中 .DNA测序筛选得到与已知tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 的基因顺序完全相同的克隆 .对带有tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 基因的 2个转化子 (MT -Leu1和MT- Leu2 )表达条件进行了优化 ,MT- Leu1和MT- Leu2总tRNA中的亮氨酸接受活力分别达到 810 pmol/A2 6 0 和 5 60 pmol/A2 6 0 :tRNA^Leu₁ 占MT -Leu1总tRNA的5 0 % ;tRNA^Leu₂ 占MT- Leu2总tRNA的 3 0 % .经DEAE Sepharose、BD -纤维素层析柱 ,可分别将MT- Leu1和MT -Leu2的总tRNA纯化到 160 0pmol/A2 6 0 .首次准确地测得了 2种等受体tRNALeu的氨酰化反应动力学常数 .     

B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素晶体结构的分子置换法研究

以B链羧端去五肽胰岛素(DPI)结构为模型,应用分子置换法对B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素(DesB1～2DPI)晶体结构进行了研究.DesB1～2DPI晶体单位晶胞中每个结晶学不对称单位包含1个DesB1～2DPI分子.交叉旋转函数和平移函数搜索均找到了明显突出的峰,确定了DesB1～2DPI分子在晶胞中的取向和位置.进一步的三维模型重建和结构精化结果巩固了DesB1～2DPI的分子置换法研究的正确性.     

胰岛素单斜晶体(B型)结构的分子置换法研究

在含有ZnCl₂的柠檬酸缓冲体系中,保持苯酚浓度在0.76％～1.25％之间,获得了胰岛素单斜晶体(B型),空间群为P2₁,晶胞参数为:a=4.924 nm,b=6.094nm,c=4.818nm,β=95.8°,每个独立区包含有由6个胰岛素分子构成的1个六聚体。以四锌牛胰岛素六聚体作模型,用X-PLOR软件中的旋转函数程序和本实验室的分子密堆积程序,获得了胰岛素单斜晶体(B型)结构的初始相位。借助生物大分子刚体精化技术对模型进行了初步精化,用能量极小化的立体化学制约的最小二乘精化技术并辅以差值Fourier图人工分析对模型进行了调整和精化。最终R因子为22.4％,键长和键角与标准键长和键角的偏差分别为0.0022nm和4.7°。     

ATP合成酶的结合变化机制和旋转催化——1997年诺贝尔化学奖的部分工作介绍

保罗.博耶(P.D.Boyer)教授为阐明ATP酶作用机制所提出的结合变化机制有两个基本要点：一是ATP合成所需要的能量原则上是用于促进酶上紧密结合的ATP的释放和无机磷、ADP的结合;二是在净ATP形成过程中,酶上的各催化部位是高度协同地顺序起作用的.γ亚基在F₁-ATP酶中的旋转运动使三个催化部位构象不对称是实现结合变化的基础.高分辨率牛心线粒体F₁-ATP酶的晶体结构发表以后,出现了一些支持旋转催化机制的直接实验证据.     

马肝醇脱氢酶催化有机硅酮不对称还原反应动力学

探讨了马肝醇脱氢酶(HLADH)催化三甲基硅乙酮及其碳结构类似物不对称还原反应动力学.结果表明,在酶浓度低于150 mg/L时,底物浓度与反应初速度的关系符合米氏动力学方程;HLADH催化三甲基硅乙酮不对称还原反应的K_m、v_max和E_a分别为2.67 mmol/L、0.118 mmol/(L·min·mg)和37 kJ/mol, 其碳结构类似物的相应值分别为3.56 mmol/L、0.084 mmol/(L·min·mg)和61 kJ/mol.     

内毒素休克大鼠肝线粒体质子跨膜转运的改变

用稳态荧光探针标记技术动态观察内毒素休克大鼠肝亚线粒体质子跨膜转运的变化.发现,休克5 h ATP、NADH和琥珀酸钠所致的9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA）最大荧光淬灭值（ΔA_max）显著低于对照组(P＜0.05)、最大荧光淬灭时间（T_ΔAmax）、半数荧光淬灭时间（T_1/2ΔAmax）非常显著延长(P＜0.01),肝线粒体质子跨膜转运能力下降;膜脂分子烃链和膜脂深层次流动性下降;线粒体膜PLA₂活性增加;血浆脂质过氧化产物MDA和线粒体MDA含量均显著增加.可能膜脂质过氧化和磷脂酶A₂的水解是引起内毒素休克肝线粒体质子转运功能改变的重要因素.