大肠杆菌等受体tRNALeu的T7 RNA聚合酶转录

用化学方法合成编码 2个大肠杆菌tRNA^Leu(tRNA^Leu₁和tRNA^Leu₂ )的基因和T7启动子 ,分别克隆到pUC1 9载体上 ,并在纯化的T7RNA聚合酶的体外转录系统中转录出不含修饰核苷酸的tRNA^Leu.在T7转录体系中 ,亚精胺对转录有负影响 .在最适转录条件下 ,可以得到有活力的RNA转录物的量是模板DNA的 2 5 0倍左右 .在大肠杆菌亮氨酰 tRNA合成酶的催化下 ,2种经体外转录产生的未修饰等受体tRNA^Leu(tRNA^Leu₁和tRNA^Leu₂ )的亮氨酸接受能力基本相同 ,但只有从体内纯化对应的tRNA^Leu的四分之一左右 ,表明修饰核苷酸在tRNA^Leu氨酰化过程中起着较为重要但非关键的作用 .     

酵母tRNAAla中修饰核苷酸T54,Ψ55的生物功能

酵母tRNA^Ala的3′半分子与一个11聚的DNA片段(5′GGAATCGAACC3′)杂交后用RNase H酶解,该酶能在Ψ₅₅的3′侧定点剪切,这样就制备得片段C₃₆-Ψ₅₅该片段经1～2个高碘酸氧化和β-消去得片段C₃₆-T₅₄和C₃₆-G₅₃机器合成了3个酵母tRNA^Ala的片段,分别j是片段C₅₆-A₇₆,U₅₅-A₇₆(以U替代Ψ₅₅)和U₅₄-A₇₆(以UU替代T₅₄Ψ₅₅).合成和制备的片段以适当的组合用T₄RNA连接酶连接,产物是酵母tRNAtRNA^Ala的3′半分子或其类似物.3种3′半分子或其类似物分别与天然5′半分子连接得重组天然酵母tRNA^Ala(tRNAr)和2个酵母tRNA^Ala的类似物:(1)tRNAa(以U替代Ψ₅₅),(2)tRNAb(以UU替代T₅₄Ψ₅₅).体外测定了它们的丙氨酸接受活力和参入活力,发现酵母tRNA^Ala的类似物tRNAa和tRNAb与天然重组酵母tRNA^Ala相比,它们的氨基酸接受活力分别降低了25%和55%,参入活力分别降低了35%和30%.说明酵母tRNA^Ala中的修饰核苷酸T₅₄和Ψ₅₅对该tRNA的功能有重要的影响.     

E.coli tRNALeu的提纯

本文报道一种E.coli tRNA^Leu简便而稳定的纯化方法。粗tRNA经过BD-Cellulose柱层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳两个步骤即可得到亮氨酸接受能力为1400pmol/A₂₆₀单位的tRNA^Leu。     

水稻线粒体tRNATrp突变体的克隆和氨酰化活力鉴定

为了研究tRNA^Trp的氨基酸接受茎中除两对半碱基以外的特异性元件,设计并完成了4种水稻线粒体tRNA^Trp向枯草杆菌tRNA^Trp的突变体 (MPB0, G1A和U5G/A68C;MPB1,C2G/G71C;MPB2,C4G/G69C;MPB3,C2G/G71C和C4G/G69C),体外转录并用枯草杆菌和人这两种不同种属来源的色氨酰 tRNA 合成酶(TrpRS)测定了这些 tRNA^Trp 分子的氨酰化活力(K_cat/K_M)．结果表明,这些突变体具有被枯草杆菌TrpRS氨酰化的能力,与野生型水稻线粒体tRNA^Trp相比,MPB0被枯草杆菌TrpRS氨酰化的活力提高了5倍,MPB1和MPB2被枯草杆菌TrpRS氨酰化的活力分别提高了40和53倍,MPB3则提高了140倍,为野生型枯草杆菌tRNA^Trp的34%,而人色氨酰 tRNA合成酶氨酰化这4个突变体的活力都很微弱．揭示了水稻线粒体tRNA^Trp氨基酸接受茎上的2个碱基对C2/G71和C4/G69的突变,对枯草杆菌TrpRS的识别起重要作用,由此推测,接受茎上的2个碱基对C2/G71和C4/G69也是线粒体tRNA^Trp重要的特异性元件．     

牛肝TrnaIle的序列分析和二级结构

用随机降解法和Donis-Keller酶分析法,测定了牛肝tRNA^Ile序列.牛肝tRNA^Ile长77个碱基;G5·G69不配对为其显著特征.依据tRNA螺旋区和环区自由能大小及Holley模型,确定了tRNA^Ile的二级结构.     

用T7 RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNAIle

采用PCR技术从rec-M13mp18中扩增出120 bp的大鼠肝tRNA^Ile合成基因片段,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板,利用T7 RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNA^Ile基因,生成不含修饰碱基的tRNA^Ile,并对体外转录反应条件进行了优化,回收的tRNA产量可达DNA模板量的40倍.     

HIV/AIDS患者抗病毒治疗前HIV-1耐药情况调查及外周血CD8+T细胞CD38表达水平研究

摘要 目的：分析人免疫缺陷病毒/艾滋病（HIV/AIDS）患者抗病毒治疗前HIV-1耐药以及影响因素,探讨HIV/AIDS患者外周血CD₈⁺T细胞CD₃₈表达（CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比）与CD₄⁺T淋巴细胞计数的相关性。方法：选择2016年3月至2019年12月我院接诊的442例HIV/AIDS患者（HIV/AIDS组）和163例同期于我院进行体检的健康志愿者（对照组）,HIV/AIDS组扩增pol基因,进行HIV-1基因耐药分析,检测CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比、CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数。分析HIV/AIDS患者HIV-1耐药的影响因素,分析CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比与CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数相关性。结果：HIV/AIDS组442例HIV/AIDS患者中376例获得HIV-1 pol基因序列,HIV-1耐药35例,耐药率9.31%（35/376）。单因素分析结果显示耐药组和非耐药组在年龄、文化程度、感染途径、HIV病毒载量方面差异有统计学意义（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示同性性传播、注射吸毒、高HIV病毒载量是HIV/AIDS患者抗病毒治疗前HIV-1耐药的危险因素（P＜0.05）。HIV/AIDS组外周血CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数低于对照组（P＜0.05）,CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比高于对照组（P＜0.05）。CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比与CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数呈负相关（P＜0.05）。结论：抗病毒治疗前HIV/AIDS患者存在一定HIV-1耐药率,传播途径、HIV-1病毒载量与HIV-1耐药有关。CD₈⁺T细胞表面CD₃₈过表达与HIV/AIDS 患者CD₄⁺T T细胞的过度消耗有关。     

胞外ATP对AlCl3诱导的细胞死亡过程中胞内H2O2和Ca2+水平的影响及其生理机制分析

该实验以烟草悬浮细胞 BY 2 为材料,在烟草悬浮细胞中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20 mmol·L^-1AlCl₃,以等体积去离子水处理的悬浮细胞液为对照,并依据前述实验结果选择0.15 mmol·L^-1 AlCl₃,分别添加5 mmol·L^-1 DMTU(H₂O₂ 抑制剂)、20 μmol·L^-1CaCl₂、15 μmol·L^-1 LaCl₃(Ca²⁺通道抑制剂)和50 μmol·L^-1 ATP设计多项处理,分析胞外ATP(eATP)对铝离子(Al³⁺)胁迫引起的植物细胞死亡及其胞内H₂O₂、Ca²⁺的影响,以揭示Al³⁺胁迫下植物调节细胞死亡的可能机制,进一步扩展对eATP功能的认知。结果显示：(1)随着 AlCl₃ 胁迫浓度的提高,细胞死亡水平和胞内H₂O₂水平上升,而胞内Ca²⁺和eATP水平则逐渐降低。(2)外援施加H₂O₂抑制剂 DMTU(二甲基硫脲)和Ca²⁺能够有效缓解AlCl₃诱导的细胞死亡水平的上升;而Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃(三氯化镧)则加剧了AlCl₃胁迫下的细胞死亡。(3)在AlCl₃胁迫下对细胞添加外源ATP,能够缓解AlCl₃胁迫下胞内H₂O₂水平上升和Ca²⁺水平下降的同时,并显著降低AlCl₃胁迫导致的细胞死亡。研究表明, Al³⁺以剂量依赖的模式提升细胞死亡和细胞内H₂O₂的水平并降低胞内Ca²⁺和eATP水平,AlCl₃诱导的细胞死亡受到H₂O₂和Ca²⁺水平变化的调节,eATP可以通过调节H₂O₂与Ca²⁺水平缓解AlCl₃诱导的细胞死亡。推测Al³⁺胁迫可能通过抑制钙离子通道而破坏了细胞内H₂O₂和Ca²⁺之间的协同关系,外源ATP对Al³⁺诱导H₂O₂上升的缓解作用可能是由于其提升了细胞的抗氧化能力。     

免耕稻田氮肥运筹对土壤NH3挥发及氮肥利用率的影响

通过大田试验,设置5种不同的施肥比例(基肥:分蘖肥:拔节肥:穗肥-2:2:3:3(R1)、3:2:2:3(R2)、4:2:2:2(R3)、4:3:1:2(R4)与0:0:0:0(CK)),研究氮肥运筹对稻田NH₃挥发和氮肥利用率的影响。结果表明,(1)相对于不施肥,施肥显著提高了稻田NH₃挥发量。氮肥施用后,NH₃挥发损失量占施氮量的6.2%-8.5%,其中,以分蘖期NH₃挥发损失量最大,齐穗期次之,苗期和拔节期最小。施肥处理间,处理R1稻田累积NH₃挥发量最小,显著低于其它施肥处理,比处理R2、R3和R4分别低9.1%(P<0.05)、10.9%(P<0.05)和17.7%(P<0.05)。(2)相关分析表明,田面水NH₄⁺、pH值和土壤NH₄⁺和pH值均与稻田土壤NH₃挥发通量呈显著或者极显著相关;(3)处理R1水稻氮肥利用率相对于处理R2、R3和R4增加了28.4%(P<0.05)、55.4%(P<0.05)和74.9%(P<0.05)。研究表明,氮肥后移能有效降低免耕稻田NH₃挥发,提高水稻的氮肥利用率。     

Mg2＋对阿霉素引起心肌线粒体F1F0变化的保护

抗肿瘤药物阿霉素(ADM)对心肌线粒体F₁F₀-复合体呈现抑制而对F₁-ATPase无抑制,这表明ADM可能是通过膜脂起作用的,适当浓度Mg²⁺能降低ADM对复合体的抑制.经 ³¹P-NMR和标记荧光探针NBD-PE,DPH,MC-540以及内源荧光等的测定,结果表明ADM可能首先通过诱导F₁F₀膜脂形成非双层脂结构,继而影响了膜脂的堆积程度和流动性,进而引起F₁F₀-复合体酶蛋白构象的改变,最终导致酶活力的降低.Mg^2＋则可能由于与ADM竞争与心磷脂的结合,而对ADM引起F₁F₀的变化产生保护作用.     

玉米叶表皮短细胞发育过程的形态特征及栓质细胞作用研究

采用大田试验,直接撕表皮或对叶片进行固定处理,结合单染、复染、荧光染色等多种细胞学显色方法,利用光学显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜系统观察玉米叶表皮短细胞的发生时期、发育过程、分布规律以及形态结构特征,研究K⁺和H₂O₂在栓质细胞中的分布变化与表皮其它细胞中K⁺和H₂O₂的分布及气孔器开关的关系,为进一步挖掘短细胞的新功能提供细胞学依据。结果表明：（1）短细胞是同步发生在玉米多叶位新表皮组织形成过程中,所有植株从第7新生叶,大部分第6叶,极少数第5叶的基部同时开始发生短细胞,之后新生的高位叶也均发生短细胞,并随着叶位的升高叶片各部位短细胞密度均增大,所有植株的1~4叶（因不再生长）均无短细胞出现。（2）初期发育的叶表皮细胞进行不对称分裂,生成相互交替的长、短细胞,有的短表皮细胞横（垂直叶脉）分裂,形成栓质细胞和硅质细胞对;栓质细胞基部与叶肉细胞相邻,硅质细胞嵌在栓质细胞和表皮细胞间偏上。（3）有短细胞发生的叶片,宏观背面发亮且覆有蜡质层,微观表皮细胞的着色特性发生了变化;栓质细胞为面包形柱状细胞,硅质细胞为哑铃形扁细胞。（4）气孔器张开时,栓质细胞中没有K⁺和H₂O₂的积累;气孔器关闭时,栓质细胞中积累了大量的K⁺和H₂O₂,且栓质细胞中K⁺和H₂O₂的积累始终与副卫细胞中K⁺和H₂O₂的积累变化一致,而硅质细胞和长细胞没有K⁺和H₂O₂的积累。该研究确定了玉米叶表皮短细胞发生的时期;展示了其发育过程的形态学变化特征;发现栓质细胞中K⁺和H₂O₂的积累随气孔器开关呈周期性变化,且与副卫细胞中K⁺和H₂O₂的积累变化保持一致。     

邻二氮菲－Fe2＋氧化法检测H2O2／Fe2＋产生的羟自由基

报告检测H₂O₂/Fe^2＋所产生羟自由基的新方法. 羟自由基氧化反应后, 邻二氮菲-Fe^2＋的A₅₃₆明显下降, 且△A₅₃₆与邻二氮菲, FeSO₄及H₂O₂呈量效关系, 随反应时间延长, △A₅₃₆依幂函数规律上升. 此法试验结果表明, 甘露醇, 抗坏血酸及硫肥清除羟自由基作用呈明显的量效关系.     

肺腺癌A549/DDP细胞周期变化及其多药耐药性

用Fura-2/AM标记药物敏感的肺腺癌细胞A₅₄₉和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A₅₄₉/DDP两种细胞胞内游离Ca²⁺,用碘化丙锭(PI)标记细胞DNA,检测其胞内Ca²⁺的变化及两种细胞增殖能力和细胞周期.实验结果表明,抗药性细胞株A₅₄₉/DDP胞浆内游离Ca²⁺的浓度仅为药物敏感细胞株A₅₄₉的1/3左右,同时前者的细胞增殖能力较后者明显增强,而且细胞周期也明显缩短.当用BAPTA-AM和EGTA或A₂₃₁₈₇和Thapsigargin处理细胞以降低或升高其胞内自由Ca²⁺浓度时可改变细胞的生长周期,二者也呈现明显差别.这些结果表明,对顺铂产生耐药性的人肺腺癌A₅₄₉/DDP细胞胞内Ca²⁺浓度的降低,可能影响细胞的增殖,缩短细胞的生长周期,特别是影响起决定作用的G1期,从而有利于肿瘤细胞多药耐药特性的维持.     

多形核白细胞产生的NO和O2-自由基主要形成 ONOO-

用ESR自旋捕集技术研究了人多形核白细胞(PMN)受促癌剂佛波醇(PMA)刺激产生O₂^-和NO自由基的相互作用.发现加L-精氨酸使在PMA刺激PMN体系中捕捉到的O₂^-明显减少,加N^G-甲基精氨酸(NGMA)使在PMA刺激PMN体系中捕捉的O₂^-明显增加.用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶和光照核黄素体系证明,加L-精氨酸使PMA刺激PMN产生NO^-·自由基与O₂^-结合生成ONOO^-是加入L-精氨酸使PMA刺激PMN体系捕捉的O₂^-减少的主要原因,并且推算了加入不同浓度L-精氨酸PMN产生NO^-·自由基的量.用羟基自由基清除剂和ONOO^-氧化DMPO和DMSO及其对pH的依赖关系,证明了ONOO^-分解并没有直接生成羟基自由基.用依赖鲁咪诺的化学发光法研究了人多形核白细胞受促癌剂PMA刺激产生NO^-·自由基动力学过程.另外,用化学合成的NO^-·自由基和过氧亚硝基在模型体系研究了它们的ESR和化学发光特征.说明PMA刺激PMN生成的NO^-·和O₂^-自由基反应形成的ONOO^-是引起化学发光的主要形式.     

亚硒酸钠对巨噬细胞内游离Ca2+和Mg2+的影响

用单细胞阳离子测定系统研究了SeO^2-₃对巨噬细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的影响.实验结果表明:SeO^2-₃高于10^-4mol/L时,有显著的细胞毒性.SeO^2-₃对细胞的毒性作用使细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的浓度升高但Ca²⁺浓度的升高速率比Mg²⁺快.还有,高于10^-4mol/L的SeO^2-₃对红细胞膜上的Ca²⁺-ATP酶活性有明显抑制作用.     

β-Agkistrodotoxin的聚合与异构体观察

中国江浙产短尾蝮蛇突触前神经毒素(β₁-Agkistrodotoxin,β₁-AgTx)经制备电泳被进一步纯化.经SDS-PAGE鉴定, 观察到天然β₁-AgTx以及经电泳纯化获得的碱溶β₁-AgTx-OH^-成分在电泳图谱上出现的聚合谱带, 然而这些聚合谱带的含量似乎并不随时程的延长而明显地增强.另经双向电泳分析发现, 无论是天然的β₁-AgTx或经电泳纯化获得的碱溶β₁-AgTx-OH^-成分均含有三个具有不同等电点(pI 7.0, 5.8和5.4)及不同含量比例的异构体谱带.天然β₁-AgTx中三个异构体的含量比并不随时程延长而明显改变, 碱溶β₁-AgTx-OH^-成分中的三个异构体的含量比则随着时程的延长而发生显著的变化.     

邻苯三酚-碳酸盐缓冲液化学发光体系的研究

用化学发光法研究了邻苯三酚碱性自氧化产生O₂^-_·的发光行为.通过对测定条件的研究, 得出最佳测定方案.改进后的方法不需使用发光剂Luminol, 所用试剂价廉易得, 且方法稳定, 重现性好.此法灵敏度远高于邻苯三酚自氧化的其他文献报道法.     

夏季台湾海峡南部海域上层水体的生物固氮作用

2011年6-7月,利用¹⁵N₂示踪法实测了台湾海峡南部海域的生物固氮速率,结合温度、盐度、天然颗粒物氮同位素组成的分布,分析并讨论了影响研究海域生物固氮速率的环境因素。结果表明,夏季台湾海峡南部海域的生物固氮速率介于 168-1080 nmol m^-3 d^-1之间,平均为537 nmol m^-3 d^-1,较高的生物固氮速率大多出现在次表层水体中。研究站位的积分固氮速率变化范围为11-40 μmol m^-2 d^-1,平均为23 μmol m^-2 d^-1。积分固氮速率的空间变化与不同水团的影响有关,在受黑潮水影响的海域,生物固氮速率较高,而在上升流和受河流冲淡水影响的海域,生物固氮速率较低,说明较低的水温及较高的无机氮营养盐可能会抑制研究海域的生物固氮作用。研究海域天然颗粒物δ¹⁵N与生物固氮速率之间呈现良好的负相关关系,表明天然颗粒物氮同位素组成可定性指征研究海域生物固氮作用的强弱。     

五个氨基酸磷光性质的研究

研究了5个氨基酸的磷光特性、光谱、寿命和最小检测量.以色氨酸(Trp)的磷光最强,在λ_ex/λ_em=290/438 nm,最小检测量为1 ng,酪氨酸(Tyr)其次(284/390 nm)为Trp的1/10,苯丙氨酸(Phe)在276/386 nm,脯氨酸(Pro)在308/454 nm,组氨酸(His)在320/466 nm,其磷光只有Trp的1%.Phe与Trp磷光寿命最长,在7 s左右;His最短,只有0.49 s;Tyr 2.8 s,Pro 1.34 s.另外研究氨基酸在甲醇,乙醇,丙醇,丁醇中及pH对氨基酸磷光性质的影响.还计算了Stokes位移能量及激化态pK^*_a值.     

背瘤丽蚌F型线粒体基因组全序列分析

部分双壳贝类的线粒体遗传方式是特殊的双重单亲遗传方式:F型存在于雌性体细胞组织和性腺中,M型仅存在于雄性个体的性腺中。通过LA-PCR扩增、SHOT-GUN测序、软件拼接获得背瘤丽蚌(Lamprotula leai)F型线粒体基因组全序列。线粒体基因组全长为16530 bp,包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA其中包括2个tRNA^Ser和2个tRNA^Leu,2个SrRNA及27个长度不等的非编码区,最长的两个非编码区分别为969 bp、228 bp。比较分析已登录到GenBank中的淡水蚌类F型线粒体结构特征,结果显示背瘤丽蚌F型A+T含量为60.28%,表现出A+T偏好性,淡水蚌类线粒体基因组长度的差异主要表现为非编码区长度的差异。此外,背瘤丽蚌mtDNA的COⅡ-12S rRNA区域基因排列存在差异,是ND3、tRNA^His、tRNA^Ala、tRNA^Ser1、tRNA^Ser2、tRNA^Glu、ND2、tRNA^Met 8个基因发生重排造成。F型线粒体序列构建的系统进化树中,淡水蚌类和海水双壳贝类分别聚为一支。研究结果为进一步研究淡水珍珠蚌的DUI线粒体遗传方式和种质资源保护奠定基础,为双壳贝类mtDNA基因重排提供依据。