Bax基因cDNA的分子克隆研究

细胞编程死亡（ｐｒｏｇｒａｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ）是细胞生理性死亡的一种主要形式。Ｂａｘ具有抑制细胞编程死亡的作用。本研究采用ＰＣＲ方法,从人肿瘤细胞ＨＬ—６０ｃＤＮＡ文库中扩增出若干个ｂａｘｃＤＮＡ片段,然后将它们分别与ＰＧＥＭ—Ｔ测序质粒载体连接,并转化到大肠杆菌ＪＭ１０９中去。用蓝／白法筛选重组菌落,经酶切分析及ＰＣＲ鉴定,获得了插入片段大小约为０．４ｋｂ及１．１ｋｂ的ＢａｘｃＤＮＡ重组质粒ＰＢａｘｌ和ｐＢａｘ２。这些片段的测序及表达工作正在进行之中。     

GA2ox1氧化酶基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR从拟南芥基因组中克隆到GA2ox1基因,通过Gateway克隆技术构建原核重组表达载体pDEST17-GA2ox1,并转化大肠杆菌BL(21)star,对蛋白原核表达条件进行优化.结果表明,最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导6 h.蛋白表达形式为包涵体,与Biotech对GA2ox1基因在大肠杆菌中的表达情况推测的结论一致.重组蛋白分子质量约为40 kD,经Ni Sepharose亲和层析柱纯化和Western blot鉴定得纯度90%以上的GA2ox1重组蛋白.研究结果为GA2ox1抗体制备及蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

豌豆外源凝集素基因的克隆及序列分析

从豌豆幼叶分离基因组ＤＮＡ,设计特异引物,用聚合酶链式反应方法扩增出豌豆外源凝集素基因并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＥｃｏＲＶ位点。进一步亚克隆至ｐＵＣ１９。序列分析表明,克隆到的片段大小为８３２ｂｐ,包含了豌豆外源凝集素基因完整的编码序列。该基因无内含子,同报道的已知序列相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为９９．６％和９８．９％。     

箭筈豌豆两个肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

通过同源克隆获得了箭筈豌豆两个不同的Actin基因片段,为研究该箭筈豌豆其它基因的表达状况提供了内标参照。根据近缘物种Actin基因序列设计一对引物,通过RT-PCR技术分别从叶片和果实材料中克隆获得了两条不同的Actin基因片段。生物信息学分析表明,叶片中克隆的片段长度604 bp,编码201个氨基酸;果实中克隆的片段长度677 bp,编码225个氨基酸。两条序列与其它物种Actin基因的碱基序列相似度高于80%,氨基酸序列相似度高于93%。将来自叶片和果实的两条序列分别命名为VsACT7和VsACT11,并在GenBank注册,登录号分别为HM004434和GU946218。     

解毒酶基因cDNA克隆和高效表达

昆虫抗药性的一个重要机制是其产生的解毒酶可以将大剂量的农药脱去毒性[1] 。酯酶活性升高是库蚊对有机磷杀虫剂抗性的主要机制 ,与酯酶Ｂ1有关的抗性最高[2 ,3] 。酯酶与有机磷杀虫剂有非常强的结合力 ,可以迅速与之形成强结合体[4 ] 。酯酶的解毒作用具有很高的手性专一性 ,在有机磷化合物 ,特别是高毒的有机磷化合物的解毒作用中非常重要[1] 。高效表达解毒酶基因 ,将昆虫解毒酶用于人畜解毒的目的研究还未见报道。本文报道在大肠杆菌中高效表达昆虫解毒酶 ,并将产物用于实验动物有机磷中毒的解毒研究 ,为昆虫抗性相关基因的开发利用提…     

豌豆卷须肌动蛋白Ⅱ类异型体cDNA克隆的序列分析

分析１５个豌豆卷须肌动蛋白ｃＤＮＡ 克隆的限制性内切酶图谱,发现在豌豆卷须中至少存在三类肌动蛋白异型体,分别命名为Ⅰ类（ＰＥＡｃ Ⅰ）、Ⅱ类（ＰＥＡｃ Ⅱ）和Ⅲ类（ＰＥＡｃ Ⅲ）异型体．三类异型体的克隆数目分别为１０、４和１个,表明三类异型体在豌豆卷须中的表达是不同的,很可能具有组织或发育阶段的特异性．对Ⅱ类异型体的三个ｃＤＮＡ 克隆ＰＥＡｃ３、ＰＥＡｃ９和ＰＥＡｃ１１进行了全序列测定,所测定的序列已被ＧｅｎＢａｎｋ 数据库所接受．测序结果表明,ＰＥＡｃ３、ＰＥＡｃ９和ＰＥＡｃ１１的序列长度分别为１５５０、１６８０和１０９１个核苷酸,其中编码区长１１３４个核苷酸,编码的氨基酸长度为３７７（ＰＥＡｃ１１缺少编码氨基端前９６个氨基酸的核苷酸序列）．三个克隆的核苷酸序列完全相同,差别仅在于３′非翻译区的长度不同,即ｐｏｌｙ（Ａ）的加入位点不同．这说明它们可能是由同一基因转录而来,但转录后的加工过程不同．豌豆卷须中肌动蛋白基因ｐｏｌｙ（Ａ）加入位点的使用,可能与组织或发育的特异性表达有关．此外,豌豆卷须肌动蛋白三类异型体之间的核苷酸序列同源性为８０％ ,氨基酸序列同源性为９４％ ．     

一个血清抑制基因的克隆

比较血清培养细胞和血清饥饿细胞的基因表达差异,获得了一段血清饥饿细胞中特异表达的cDNA序列,以此序列出发,通过搜索表达序列标签(EST),拼接出完整的基因序列,通过PCR分段克隆获得全长cDNA序列.该基因全长5 429 bp,编码框预测有791个氨基酸残基.GenBank搜索,该基因与已有的细胞周期调控基因没有同源性.所以,该基因是一个新的与细胞周期有关的基因（GenBank接受号：AY050169）.由于该基因最初发现在无血清培养条件下表达,故叫血清抑制基因（serum inhibit gene,Si-1基因）.     

昆明小鼠无毛基因cDNA全长序列的分子克隆

无毛基因是与皮肤和被毛结构有重要关联的核受体基因,编码一个锌指结构转录因子,是甲状腺激素受体的转录辅阻遏物,并参与毛发生长周期的调控,在维持毛囊及毛囊间上皮的增殖、分化、调亡的精致平衡中扮演重要角色。参考小鼠、人的无毛基因序列,用RT-PCR方法首次对昆明小鼠无毛基因的cDNA序列进行了克隆,获得了昆明小鼠无毛基因的全长4 014 bp cDNA序列（GenBank 登录号：AY547391）,基因的CDS长度为3 546 bp。AY547391基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAT45233,由1181个氨基酸组成。昆明小鼠与国外报导的小鼠、大鼠、猪、羊、猴、人等6种动物CDS 序列同源性分别为99.9%、94.4%、83.1%、78.1%、81.9%、82.1%,氨基酸同源性分别是99.9%、92.2%、81.7%、 70.8%、 79.9%、 80.1% 。这一结果反应了无毛基因在进化过程的高度保守性。通过Blast比较昆明小鼠无毛基因与GenBank 数据库中收集的Hr 基因的mRNA,发现了4个SNP和一个缺失突变,其中3个位点没有改变氨基酸残基的性质,两个位点有氨基酸改变并证实为多态性突变位点,研究结果为无毛基因的SNPs的数据库提供了新的信息。     

大鼠FMR1同源基因cDNA的克隆,测序与选择剪接的初步分析

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从新生大鼠脑组织总ＲＮＡ扩增大鼠ＦＭＲ１同源基因的ｃＤＮＡ片段,克降至ｐＵＣ１８质粒中进行序列分析。获得从终止密码子起共１６８１ｂｐ的编码序列,尚缺少约２００ｂｐ的５‘序列。所克隆的这部分大鼠ＦＭＲ１ｃＤＮＡ,不含有对应于人ＦＭＲ１基因的外显子１２及外显子１７第一和第三剪接受点之间的序列,提示大鼠ＦＭＲ１基因也有选择剪接表达。     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗（H）为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗（M）为目标群体,进行抑制差减杂交。用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向／反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性侯克隆,从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析。证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northern杂交信号,推测它们为低丰度转录本。     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗(H)为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗(M)为目标群体,进行抑制差减杂交.用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向/反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性候选克隆.从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析,证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northem杂交信号,推测它们为低丰度转录本.     

人ZP3基因的RT-PCR cDNA克隆

目的：研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法：从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT—PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果：共克隆到ZP3-A（1300bp）、ZP3-B（1180bp）、ZP3-C（1200bp）和ZP3-D（1080bp）4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的人ZP3 mRNA序列（NM-007155）相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99．92％。结论：本研究克隆到的ZP3-A cDNA片段确是人ZP3基因无疑。     

荔波连蕊茶GA20氧化酶基因的克隆及表达分析

根据植物GA20ox基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 567 bp的GA20氧化酶基因全长cDNA序列,命名为ClGA20ox2(GenBank登录号KF823787)。序列分析表明,ClGA20ox2开放阅读框(ORF)为1 146 bp,编码382个氨基酸,5'非编码区115 bp,3'非编码区303 bp。预测的蛋白质分子量为43.56 kD,等电点为7.02,所推导的蛋白氨基酸序列与夹竹桃和杨树GA20ox蛋白的同源性分别为73%和72%。ClGA20ox2与其它植物GA20ox蛋白比较,构建系统进化树,结果显示山茶GA20ox蛋白与夹竹桃和杨树的GA20ox蛋白的亲缘关系最为密切。实时定量PCR结果显示,该基因在荔波连蕊茶的根、茎、叶和种子中均有表达,其表达模式却不同:ClGA20ox2基因在二年生茎段中的表达丰度最高,在顶端分生组织中表达丰度最低,在嫩叶和根中表达丰度较高,成熟叶片和种子表达丰度较低。     

小麦春化相关基因的分子克隆与功能分析

小麦春化相关基因的分子克隆与功能分析@种康$中国科学院植物研究所!北京100093@许智宏$中国科学院植物研究所!北京100093@谭克辉$中国科学院植物研究所!北京100093小麦;;基因;;分子克隆     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

牦牛白细胞介素2(IL2)基因cDNA 的分子克隆和表达研究

目的克隆牦牛免疫基因并研究其免疫特性。方法以伴刀豆球蛋白A（ConA）激活的体外培养的牦牛血液淋巴细胞,提取激活淋巴细胞的总RNA,用RT—PCR方法,从中克隆出白细胞介素2cDNA,连接到T载体上测序,并亚克隆到pC,EX4T-1表达质粒,在大肠杆菌进行了重组表达,纯化融合表达YIL2产物,MTT比色法测定其体外刺激牦牛血液淋巴母细胞增殖的免疫活性。结果YIL2cDNA序列分析显示：在其编码区442位点的一个碱基发生突变（由C突变为T）,从而导致终止密码子（TAA）出现,使YIL2蛋白表达提前终止,与其它牛IL2蛋白相比少了8个氨基酸。MTT比色法测定结果表明重组牦牛IL2蛋白体外能显著促进牦牛淋巴母细胞的增殖。结论本实验成功克隆了牦牛IL2基因,其原核表达产物具有显著的免疫活性,这为研制新型免疫增强剂来提高牦牛对各种疾病的抵抗力,增强牦牛疫苗的免疫保护率奠定了基础。     

人凝血因子Ⅶ cDNA基因的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定人凝血因子ⅦcDNA基因。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,从人胎肝总RNA中扩增人凝血因子ⅦcDNA基因,将其克隆入pGEM-T载体,对阳性克隆进行序列测定和分析。结果:经RT-PCR扩增和克隆,获得了人凝血因子ⅦcDNA基因,经序列分析表明,所克隆的基因序列正确。结论:本试验成功克隆了人凝血因子ⅦcDNA基因,为重组人凝血因子Ⅶ的研究奠定了基础。     

NOBOX基因的cDNA克隆及其特性分析

NOBOX(新生儿卵巢同源基因)是一个卵母细胞特异性表达的同源基因,在早期滤泡发生中起重要的作用。本研究结合电子克隆的方法,从猪卵母细胞中成功地克隆了NOBOX基因的全长cDNA序列(GenBank Accession No.FJ587509)。猪NOBOX基因的cDNA全长为1768 bp,包含1419 bp的开放阅读框。生物信息学分析表明NOBOX基因编码了472个氨基酸,分子量为51.08 kD,等电点为5.73。该蛋白定位于细胞核中,含有一个保守的结构域——cd00086。借助Clustalw软件,采用N-J算法构建了NOBOX蛋白的系统进化树,分析了不同物种间的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在母猪不同组织、细胞及4种孤雌激活胚胎的表达模式,结果表明该基因在母猪各组织中均有不同程度的表达,其中在心脏、肾脏和卵母细胞中表达水平较高,推测其可能在心脏、肾脏和卵母细胞中发挥着重要的作用;NOBOX基因在胚胎发育阶段的表达水平高于G-V期的卵母细胞,表明在胚胎发育阶段pNOBOX的表达增强。     

建兰Actin基因cDNA全长的克隆及其表达分析

根据单子叶植物的肌动蛋白基因(Actin)的保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术从建兰(Cymbidium ensifolium)中分离出Actin基因cDNA全长.序列分析结果表明,建兰Actin基因长度为1 434 bp,编码区长度为1 134 bp,编码377个氨基酸,将其命名为CeActin,GenBank登录号为JN613147.CeActin推导的氨基酸序列与其他植物的同源性都较高,具有高度的保守性.采用半定量RT-PCR技术分析CeActin在建兰各组织及花不同发育时期的表达情况,结果表明,表达量没有明显差异,表明CeActin基因可作为内参基因.