人细胞差异表达基因cDNA消减杂交体系的建立

为克隆肺腺癌分化相关基因, 采用诱导分化与消减杂交相结合的策略, 建立了全反式维甲酸(RA)诱导前后人肺腺癌细胞系的cDNA消减文库, 得到124个cDNA消减克隆. 经加减法杂交差异筛选、DNA和RNA印迹、cDNA全序列测定和生物学功能分析, 分离到3个在人肺腺癌细胞系分化过程中由RA激活而特异表达的新的cDNA序列这一策略和技术路线适用于分离细胞中呈过量表达或表达抑制基因的cDNA克隆, 并具有反映细胞分化过程中基因表达动态变化特征和相对简便适用的特点.     

RAI——一候选的人肺腺癌分化相关基因

通过进一步分析采用全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)诱导人肺腺癌GLC-82细胞,经cDNA文库消减杂交构建的cDNA消减文库,得到一在ATRA诱导GLC-82细胞分化过程中激活表达(retinoic acid induced,RAI)的基因的cDNA片段,应用菌落原位杂交技术在胎脑cDNA文库中进行筛选,克隆RAI的全长cDNA序列并测序.RT-PCR分析表明,RAI在多种胎儿组织中表达.结果表明,RAI可能与细胞分化有关,并在细胞基本生命活动中发挥重要作用.     

人肺腺癌细胞系cDNA文库的建立

本文以Uni-ZAP XR为载体,成功地建立了人肺腺癌高、低转移细胞系的cDNA文库。文中同时也探讨了总RNA的提取和mRNA的分离,cDNA的第一条链及第二条链的合成及克隆到载体等在建立cDNA文库过程中,几个关键性的问题。该项工作的完成,为下一步在这两株细胞系cDNA之间进行消减式杂交,筛选转移相关基因奠定了坚实基础。     

小鼠生精细胞凋亡相关基因的分子克隆

利用手术隐睾的方法建立小鼠生精细胞凋亡模型,通过光镜、电镜以及原位末端标记法（TUNEL）证实手术隐睾可成功诱导小鼠生精细胞凋亡;在此基础上应用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH)对隐睾和对侧睾丸组织的基因表达进行研究,在隐睾组织中分离得到24个高表达cDNA片段,经克隆、PCR和酶切鉴定、测序及匹配分析,证实24个cDNA片段均为新的ESTs,已被GenBank接受并给予新序列编号。任选其中3个cDNA片段作为探针进行Northern印迹杂交,证实它们在隐睾和对侧睾丸组织有差异表达。上述结果提示手术隐睾是研究生精功能降低和睾丸组织凋亡过程中基因表达的适合实验模型,所分离的差异表达cDNA序列可能与生精细胞凋亡密切相关。     

人ZP3基因的RT-PCR cDNA克隆

目的：研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法：从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT—PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果：共克隆到ZP3-A（1300bp）、ZP3-B（1180bp）、ZP3-C（1200bp）和ZP3-D（1080bp）4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的人ZP3 mRNA序列（NM-007155）相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99．92％。结论：本研究克隆到的ZP3-A cDNA片段确是人ZP3基因无疑。     

Bax基因cDNA的分子克隆研究

细胞编程死亡（ｐｒｏｇｒａｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ）是细胞生理性死亡的一种主要形式。Ｂａｘ具有抑制细胞编程死亡的作用。本研究采用ＰＣＲ方法,从人肿瘤细胞ＨＬ—６０ｃＤＮＡ文库中扩增出若干个ｂａｘｃＤＮＡ片段,然后将它们分别与ＰＧＥＭ—Ｔ测序质粒载体连接,并转化到大肠杆菌ＪＭ１０９中去。用蓝／白法筛选重组菌落,经酶切分析及ＰＣＲ鉴定,获得了插入片段大小约为０．４ｋｂ及１．１ｋｂ的ＢａｘｃＤＮＡ重组质粒ＰＢａｘｌ和ｐＢａｘ２。这些片段的测序及表达工作正在进行之中。     

冬小麦春化作用相关cDNA克隆Vrc79的分子克隆

在低温需求型植物的发育过程中,春化作用是诱导植物成花的必要因子。在冬小麦春化进程中存在着一个核酸代谢的关键期,为了探讨春化作用的分子机理,以不春化及脱春化的冬小麦京冬1号（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｊｉｎｄｏｎｇ　Ｎｏ．１）胚芽的ｍＲＮＡ为对照,通过减法杂交构建了富集冬小麦春化相关基因的ｃＤＮＡ文库,经过差异筛选分离到了一个仅在春化２１ｄ这一关键期表达,而在不春化、春化４ｄ、脱春化不表达的春化相关。ｃＤＮＡ克隆Ｖｒｃ７９。Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交及同源性分析表明它是一个在植物中新发现的不同于低温胁迫诱导基因的春化特异克隆,其对春化需求型植物的成花诱导可能起重要的调控作用。     

大鼠肝癌细胞中失活的肿瘤相关基因的克隆和筛选

本文描述了运用减式杂交技术筛选只在大鼠正常肝细胞中特异性表达,而在肝癌细胞中失活的肿瘤相关基因的实验。实验中用肝癌细胞mRNA杂交筛减正常肝细胞cDNA得到探针A,用正常肝细胞mRNA杂交筛减肝癌细胞cDNA得到探针B。文章描述了用这两种探针对2500个重组子点杂交筛选得到的与探针A杂交强的cDNA克隆中的6个:TR1-6,并主要分析了其中两个在正常肝细胞中特异性表达的情况。实验中还建立了cDNA库,以用于体外转录mRNA及今后的全长cDNA筛选。     

红菜薹春化相关基因的克隆与表达

红菜薹是一种不经春化处理就可开花的天然早花突变体.根据已报道的拟南芥和芸薹属植物春化相关基因的保守区域设计引物,通过PCR和RT-PCR方法从红菜薹中克隆得到了4个春化相关的关键基因片段:BrFRI、BrFLC、BrVIN3、BrSOC1,获得BrFRI起始密码子附近的关键序列,其中BrVIN3基因序列为首次报道,含有PHD区关键区域.Northern和半定量RT-PCR表达分析表明:BrFRI的表达不受春化作用的影响,BrFLC受春化作用的抑制,BrVIN3和BrSOC1受春化作用的诱导.     

肺腺癌中ALK基因重排的检测*

目的: 比较免疫组化(Ventana IHC)和荧光原位杂交技术(FISH)对肺腺癌ALK基因的检出率。方法: 收集200例肺腺癌患者的临床及病理资料,光学显微镜下复阅其HE切片,标记肿瘤部位,评估蜡块保存情况,制成9张组织芯片,分别采用Ventana IHC和FISH检测ALK基因。结果: 200例病例中,通过FISH检测ALK阳性有9例,通过Ventana IHC检测ALK阳性有11例,其中有两例表现为Ventana IHC(+)、 FISH(-),1例外院做过基因检测,为ALK阴性,EGFR阳性,服用凯美钠,效果良好,另1例未做过基因检测,遂进一步予RT-PCR检验,结果为ALK阴性。最终ALK阳性为9例,Ventana IHC的敏感性和特异性分别是100%和98.95%。结论: Ventana IHC在检测ALK基因重排上表现出较高的敏感性和特异性,可用于FISH检测前的筛选,以避免不必要的FISH检测。     

人蛋白C cDNA基因的克隆及序列分析

为实现人蛋白C cDNA在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性,针对人蛋白C cDNA序列设计引物,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胎肝总RNA中钓取人蛋白C cDNA,将其克隆入pIRES neo载体中,通过酶切和PCR鉴定出重组体并进行测序分析。结果表明,获得大小为1386bp的人蛋白C cDNA基因,成功构建人蛋白C cDNA载体pIRES/hPC,为进一步进行人蛋白C cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

转基因人肺腺癌细胞株的建立

以逆转录病毒ｐＬＸＳＬ为载体与人细胞介素２基因（ＩＬ－２）重组,用电穿孔技术将其重组子ｐＬＩＬ—２ＳＮ导入ＰＡ３１７细胞中,建立了逆转染病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ—２ＳＮ。应用逆转录病毒包装体系细胞上清液去转染入肺腺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１,经过２０天含Ｇ４１８培液的筛选式培养,历经了５０代的传代培养,获得了转白细胞介素２基因的人肺腺癌细胞株ＳＰＣ－Ａ１／ＩＬ－２。该细胞（ＳＰＣ－Ａ１／ＩＬ－２）经ＰＣＲ技术验证外源性目的基因（ＩＬ－２ｇｅｎｅ）导入细胞内,且证明该细胞能表达ＩＬ—２基因（有ＩＬ－２的分泌）。我们研究的目的是对肿瘤细胞的特异性抗原修饰、对肿瘤细胞进行处理。试图建立肿瘤疫苗。     

相异物种同源基因cDNA的快速克隆

介绍了一种结合生物信息学数据库的比较分析,在系统发生相近物种的棱酸保守区设计PCR引物,通过RT-PCR和RACE方法,在相异物种中快速克隆同源基因cDNA的一种简捷方法。     

结合自噬相关基因表达谱和临床因素的肺腺癌预后预测模型

对肺腺癌自噬相关基因进行生物信息学分析,结合多基因预后标志和临床参数构建能够预测肺腺癌患者预后的模型。首先,对TCGA肺腺癌数据中的938个自噬相关基因进行差异分析,获得了82个差异自噬相关基因,使用单因素Cox比例风险回归模型从差异自噬相关基因中筛选出候选基因,通过 lasso回归进一步筛选出预后相关基因,分别是ARNTL2、NAPSA、ATG9B、CAPN12、MAP1LC3C和KRT81。通过多因素Cox回归分析以构建风险评分模型,根据最优cutoff值将患者分为高低风险组,生存曲线显示高低风险组之间生存差异显著,ROC曲线显示风险评分的预测能力良好,并在内、外验证集中得到验证。同时对传统的临床因素进行单因素和多因素Cox回归分析,结果显示Stage、复发和风险评分能够独立预测预后,结合这三个独立的预后参数以构建列线图模型,使用一致性指数、校准曲线评估列线图的预测能力,结果显示预测结果与实际结果之间具有良好的一致性。通过与Stage和风险评分的比较发现,列线图的预测能力表现最佳。基于肺腺癌相关的自噬基因和临床参数构建了一个列线图模型来预测肺腺癌患者的预后生存,这可能为临床医生提供了一种可靠的预后评估工具。     

一种新的与细胞分化相关的基因在不同组织及细胞系中表达与定位

目的　研究一种新的可能与细胞分化相关的基因在正常组织、肿瘤组织及细胞系中的表达与定位 ,初步探讨该基因的作用机制。方法　利用Northern杂交方法检测 10种人胎儿组织、6种人肿瘤细胞系、4种人的肿瘤组织及癌旁组织中该基因的表达。利用免疫荧光实验检测该基因在细胞中定位。结果　该基因在人的胎儿组织及肿瘤组织和肿瘤细胞中均有高表达 ,在正常组织及癌旁组织中表达明显减弱。癌旁组织和癌组织中的表达差异有显著性 (P <0 0 5 )。该基因在K56 2 细胞中主要定位在膜上。结论　该基因可能在细胞分化及肿瘤发生中起着重要作用     

人参皂苷生物合成相关新基因GBR6的cDNA克隆及序列分析

从人参根组织中分离总RNA,使用RT—PCR扩增出人参皂苷生物合成相关基因GBR6开放阅读框(ORF)cDNA片断,并将其定向克隆入原核高效表达载体pQE30,阳性克隆经BamHⅠ和PstⅠ双酶切鉴定、测序验证与已知的GBR6ORF序列完全一致．因而成功构建了pQE30-GBR60RF融合原核表达载体,为下一步进行GBR6功能表达分析奠定了基础．     

肿瘤特异表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人肺腺癌的实验治疗

利用CEA(癌胚抗原)只在肺腺癌中表达,而不在正常肺组织中表达的特点,构建了由CEA启动子控制的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的逆转病毒载体(pCEATK),然后将pCEATK导入表达CEA的人肺腺癌细胞GL和不表达CEA的HeLa细胞,在体内外观察了Ganciclovir(GCV)的治疗效果和“旁观者效应”.结果表明pCEATK只在表达CEA的肺腺癌GL细胞中特异表达,而不在HeLa细胞表达;GL的pCEATK转染细胞对GCV的敏感性增加了992倍,在裸鼠体内GCV也可以明显抑制GL转染细胞的生长,并有明显的“旁观者效应”现象;而HeLa的pCEATK转染细胞体内外对GCV的敏感性没有明显变化.这提示由CEA启动子控制的HSV-TK的逆转病毒载体对表达CEA的人肺腺癌的基因治疗可能是治疗人肺腺癌的有效方法.     

大鼠脑谷氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

胰岛β－细胞自身抗原蛋白之一是脑中谷氨酸脱羧酶（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,ＧＡＤ,ＥＣ４．１．１．１５）同源物,以双链ｃＤＮＡ为模权,用ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑ＧＡＤ基因的ｃＤＮＡ将此包括编码５９３个氨基酸的全长ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒并用双脱的氧末端终止法测定了全部序列,证明其全长为１７７９ｂｐ,经比较发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑与Ｒｕｓｓｅｌｌ报导的大鼠脑Ｇ