美洲商陆抗病毒蛋白的研究

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins.PAP)是一种具有多种生物功能活性的蛋白质,其在广谱抗病毒方面有重要的应用价值。综述美洲商陆抗病毒蛋白的分子结构与功能,抗病毒的分子机理及其在植物基因工程中的应用。     

R22L天花粉蛋白的晶体结构

培养了R2 2LTCS的单晶 ,在SIEMENSX 2 0 0B面探测器系统上收集了一套 0 .1 91nm分辨率的X射线衍射数据 .数据处理用XENGEN程序系统完成 ,数据使用到 0 .2 2 0nm .用同晶差值Fourier法解析了突变体的晶体结构 ,经XPLOR程序修正得到了R2 2LTCS的分子结构 ,并找到了 6 1个水分子 ,最后R因子为 0 .1 82 ,键长和键角RMS偏差分别为 0 .0 0 1 3nm和 2 .770°.在R2 2LTCS分子中 ,与A1 6 1 ,A1 6 2主链氧成氢键的 2 2位精氨酸被亮氨酸取代后形成的空穴被水分子 2 91和 2 96所占据 ,与 2 2位Arg形成盐键相互作用的 1 6 8位Glu的侧链与TCS相比 ,转动了大约 5 0° ,羧基折向相反方向 ,并通过水分子 2 93与 1 6 5位的Lys侧链氨基桥连 .这些水参与的氢键网络部分代替了原R2 2的作用 .还讨论了二级结构间的保守氢键和盐键对活性口袋构象的影响     

一种改造的同时含有preS1,preS2抗原决定簇的乙肝病毒表面抗原

利用PCR方法合成的编码乙肝病毒表面抗原 preS1区氨基酸第 2 1～ 47位和preS2区第 1 2 0～ 1 46位肽段的基因片段同时分别与S基因的 5′端和 3′端 (相当于第 2 2 3位氨基酸 )融合 .融合基因被置于痘苗病毒通用载体 pGJP 5上的P7.5启动子下游 ,并通过体内同源重组 ,经筛选获得重组痘苗病毒vS2SS1 .vS2SS1感染哺乳动物细胞后 ,融合蛋白S2SS1获得表达 .对S2SS1蛋白的表达水平、分泌性、抗原性和颗粒性分析结果表明 ,S2SS1蛋白能够形成同时具有preS1 ,preS2和S抗原性的颗粒 ,并能有效地从细胞中分泌 ,其表达和分泌水平与重组痘苗病毒单独表达的S蛋白接近     

组织蛋白酶D和nm23基因蛋白在乳腺癌中的表达及与淋巴结转移的关系

采用免疫组织化学 ABC法检测了 43例乳腺癌中的组织蛋白酶 D和 nm 2 3基因蛋白的表达。结果显示组织蛋白酶D在乳腺癌组织中表达阳性率为 76 .7% (33/43)。 43例乳腺癌中 2 5例伴有淋巴结转移 ,18例无淋巴结转移 ,其组织蛋白酶D表达阳性率分别为 92 % (2 3/2 5 )及 5 5 .6 % (10 /18) ,两者之间具有显著性差异 (P<0 .0 1)。 nm 2 3基因蛋白在 43例乳腺癌中阳性率为 72 .1% (31/43)。在有淋巴结转移和无淋巴结转移的乳腺癌中 nm2 3基因蛋白阳性率分别为 6 0 % (15 /2 5 )及80 .9% (16 /18) ,nm2 3基因蛋白的表达与淋巴结转移呈显著负相关 (P<0 .0 5 )。结果提示对乳腺癌根治术后无淋巴结转移 ,但组织蛋白酶 D表达阳性 ,nm2 3基因蛋白表达阴性的患者 ,可能具有潜在的复发和转移倾向 ,应多加关注 ,并密切随访。     

B-藻红蛋白和R-藻红蛋白γ亚基的分离、特性及其在分子中的空间位置分析

紫球藻 (Porphyridiumcruentum)B 藻红蛋白和多管藻 (Polysiphoniaurceo lata)R -藻红蛋白经蛋白酶K部分酶切消化后 ,分离得到近似天然态的γ亚基 ,并且对它的光谱特性以及在藻红蛋白分子中的空间位置进行了研究 .酶解动力学分析表明γ亚基位于R- 藻红蛋白和B -藻红蛋白六聚体 (αβ) ₆的中央空洞中 .分离的γ亚基上藻红胆素的吸收峰位于 5 89nm ,荧光发射峰位于 6 2 0nm ,与藻蓝蛋白的吸收峰重叠 ,有助于藻胆体中藻红蛋白与藻蓝蛋白分子间高效能量传递 .     

美洲商陆抗病毒蛋白研究进展

美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral proteins,PAP)是一类具多种生物功能和活性的蛋白,本在阐述了该类蛋白的生化等特性的同时,综述了该类蛋白在抗植物病毒,抗动物病毒以及用作免疫毒素等方面的研究进展。     

美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表达

根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从美洲商陆夏季的叶片中克隆美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ,PAP-Ⅱ)基因。将PAP-Ⅱ基因克隆至表达载体pET-28a( )并在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明,PAP-Ⅱ蛋白在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、复性和BBSTNTA树脂柱亲和层析纯化,获得高纯度的PAP-Ⅱ蛋白。用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶有较强的抑制活性,其IC50分别约为303μg/mL,220μg/mL。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物学活性,复性纯化后蛋白对HEP-G2和Hela细胞有细胞毒作用,IC50分别为93μg/mL,102μg/mL,说明了PAP-Ⅱ蛋白能抑制肿瘤细胞的生长。构建的PAP-Ⅱ表达系统所表达的蛋白经复性后具有生物学活性,为进一步研究PAP-Ⅱ的抗HIV-1机制和抗肿瘤作用奠定了基础。     

慢性捆绑紧张致大鼠记忆受损及海马神经元NOS和Tau5的变化——组织化学与免疫组织化学研究

目的　探讨慢性捆绑紧张对大鼠学习与记忆的影响及其可能的神经生物学机制。方法　选雄性 SD大鼠 18只 ,其中 10只为实验组 ,8只为对照组。对实验组采用捆绑器每天捆绑 6 h,2 1天后用 Y迷宫对两组大鼠进行行为检测 ,并用酶组织化学和免疫组织化学方法观察海马内一氧化氮合酶 (NOS)阳性神经元及 Tau蛋白 (Tau5 )免疫反应的变化。结果　 1实验组大鼠学会躲避电击的次数为 35 .7± 7.5次 ,对照组为 2 5 .2± 2 .8次 ,P<0 .0 1;2海马右侧 CA1 区 NOS阳性神经元数目 ,对照组 2 7.2± 4.8个 ,实验组 38.9± 6 .4个 ,P<0 .0 5 ;NOS阳性神经元胞质平均灰度 ,对照组 170 .7± 11.8,实验组 16 2 .5± 12 .6 ,P<0 .0 5 ;3海马右侧 CA3 区 Tau5免疫阳性产物的平均灰度 ,对照组 16 1.7± 12 .8,实验组 145 .8± 13.8,P<0 .0 5。结论　一氧化氮产生过多而导致的神经毒性作用可能是慢性捆绑紧张导致动物学习与记忆功能受损的部分神经生物学机制 ,而海马 CA3 区神经元内所有的 Tau蛋白 (磷酸化及非磷酸化的 Tau)的总量增多说明 Tau蛋白的变化可能在此过程中起一定的作用。     

野生冬虫夏草水提物体外抗HIV-1病毒作用的初步研究

研究分析野生冬虫夏草的水溶浸提物抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的效果及其抗病毒作用的靶点。研究分别选取新鲜虫体、子座、全草、干燥虫体和子座5种不同组分,获得水溶性提取物,采用CCK-8实验检测水提物的细胞毒性;假病毒单周期感染实验评价水提物的体外抗病毒活性;体外检测水提物对逆转录酶活性的影响,应用表面等离子共振(SPR)技术检测水提物与HIV-1Vif蛋白的相互作用。这5种虫草水提物均具有显著的体外抗HIV-1病毒活性,抑制HIV-1逆转录酶的活性,新鲜子座水提物与Vif蛋白有良好的体外结合力。本实验明确了野生冬虫夏草的体外抗病毒活性,其作用机制可能与抑制逆转录酶活性和体外Vif蛋白有关,研究将为抗HIV-1病毒药物的研发提供实验基础。     

核糖体蛋白质在翻译层次上调节λN基因表达的机理

报道大肠杆菌核糖体蛋白质S1 2或L2 4突变体均可以在翻译层次上抑制λN基因表达 .为研究其机理 ,用DNA外切酶Ⅲ(DNAExoⅢ)对λN lacZ融合基因上的λN基因部分进行了 5′→ 3′的缺失 ,以期改变λN基因的TIR(Translationalinitiationregion)或编码区 .经DNA序列分析共得到 2 3种缺失的λN lacZ融合基因 .比较它们在野生型菌株与核糖体蛋白质突变体内的β 半乳糖苷酶活性的结果表明 :( 1 )核糖体蛋白质S1 2突变体可以影响 30S小亚基同λN基因的TIR识别与结合 ,从而不利于 30S起始复合物形成 ,降低了翻译起始效率 ;( 2 )λN基因的编码区也是造成它在S1 2突变体内表达下降的原因 ;( 3)核糖体蛋白质L2 4突变体抑制λN基因表达的原因与翻译起始和λN基因 5′端的编码区无关 ,而可能与其 3′端结构基因有关     

耐热甜味蛋白brazzein的溶液NMR结构研究——二级结构和分子骨架

brazzein是从非洲西部野生植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果实中提取的一种甜味蛋白 .在所有已知的甜味蛋白质中 ,brazzein的分子量最小 ,水溶性最好 ,并且具有很好的热稳定性 .利用二维核磁共振 ( 2DNMR)技术研究brazzein的溶液三维结构 ,完成了包括主链和侧链在内的所有质子共振峰的序列归属 .brazzein的二级结构包含一段α螺旋 ( 2 1～ 2 9) ,一段较短的 310 螺旋 ( 1 4～ 1 7)和两股反平行 β折叠 ( 34～ 39,44～ 5 0 ) ,分子N端可能形成了第 3股 β链 ( 5～ 7) .比较研究发现 ,该甜味分子骨架CSαβ与蝎毒、昆虫防卫素和植物抗菌蛋白γ 硫素的分子支架基本相同 .以此为基础 ,讨论了这种多功能分子支架的意义 ,可能的甜味活性中心及其热稳定性的结构基础 .     

榆黄蘑中一种抗病毒蛋白的纯化及其抗TMV和HBV的活性

采用阴离子交换层析和凝胶层析方法从新鲜食用菌榆黄蘑 (Plearotuscitrinopileatus)中进行了抗病毒蛋白的纯化 ,结果获得了一个纯化蛋白YP4 6 4 6 ,经SDS PAGE可确定其分子量为 2 7.4kD。以半叶法在枯斑寄主心叶烟上检测该蛋白对烟草花叶病毒 (TMV)的抑制率 ,发现有较好的抗TMV活性 ,其抑制TMV的中浓度为 0 .2 4 μg/mL。同时以HepG2 .2 .2 .15细胞株为模型 ,对所获得的蛋白进行体外抗乙型肝炎病毒效果的评价。结果表明该蛋白对HBsAg的 5 0 %抑制时的浓度为 0 .0 8μg/mL ,但对HBeAg效果不大     

人促甲状腺素受体膜外区蛋白在原核系统表达及其生物活性鉴定

为研究重组人促甲状腺素受体 (hTSHR)膜外区表达产物及其生物活性与免疫活性 ,将hT SHR膜外区编码基因 (编码第 3～ 4 2 0位氨基酸 )重组到表达型质粒pGEX 4T 3上 ,测序结果表明序列正确 ,未改变读码框架 .然后转入E .coliAd4 94进行诱导表达 .纯化后的表达产物经SDS PAGE、Western印迹及放射受体法分别检测其分子量、免疫活性和生物活性 .重组TSHR3～ 4 2 0 膜外区蛋白 (简称TSHR3～ 4 2 0 )产率为 15 9～ 2 0 2 μg L培养基 ,分子量为 4 8.9kD ;融合蛋白 (简称GST TSHR3～ 4 2 0 )分子量为 75 .4kD .两种表达产物都可与TSHRAb反应 ;TSHR3～ 4 2 0 可与12 5I TSH结合 .     

编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因在人睾丸组织表达的研究

抗人精子膜蛋白的单克隆抗体YWK-Ⅱ,能引起人精子凝集和抑制体外穿卵,并发现在睾丸组织中至少有4种形式的mRNA对应于YWK-Ⅱ抗原,可能是同一基因转录而不同方式剪切的产物.从人睾丸λgt10 5’Stretch cDNA文库中筛选,得到1个4kb大小的cDNA,命名为 C211.在 C211的 5’变异区和 3’相对稳定区中选择了2段.DNA分别作为转录探针的模板,5’端为943 bP和3’端为1.5kb的片段,将以上二个片段与含SP6和T7启动子的PGEM3Z载体进行重组,采用体外转录,地高辛标记的方法,分别合成2,tRNA探针,对人睾丸组织进行原位杂交.人睾丸YWK-ⅡC211基因片段地高辛(Dig)标记的5’端和3’端Antisense cRNA探针均与支持细胞质中的mRNA杂交,证明YWK-Ⅱ抗原蛋白在Sertoli细胞中合成,并又镶嵌在生精细胞膜上,最终定位于精子头部赤道极.     

PR65A 调控抗病毒蛋白ZAP的活性

锌指结构抗病毒蛋白(ZAP)能够特异性地识别病毒RNA并促进其特异性降解,从而抑制病毒的复制．ZAP不能独立地发挥抗病毒的功能,需要招募细胞内很多因子,包括外切酶复合体(exosome)、RNA解旋酶p72 等．通过蛋白质组学分析方法,我们找到了与ZAP可能存在相互作用的一些蛋白质并证实蛋白磷酸酶2调节亚基A的?琢亚型(PR65A)与ZAP之间存在着直接的相互作用．细胞内PR65A的表达水平,降低削弱ZAP的活性, 表明PR65A是ZAP发挥最佳抗病毒活性所必需的．这丰富了我们对ZAP抗病毒作用机理的认识,同时也为更好地利用其抗病毒活性提供了重要的指导．     

铜离子对钝顶螺旋藻完整细胞中光系统Ⅱ活性和藻胆体能量传递的影响

Cu2 抑制钝顶螺旋藻 ( Spirulina platensis)完整细胞中电子传递活性 ( H2 O→ MV) ,并抑制 PS 的放氧活性。低浓度的 Cu2 处理 ,使钝顶螺旋藻细胞中藻蓝蛋白荧光发射峰位置蓝移、发射强度改变 ,表明藻胆体中能量传递发生了变化。Cu2 处理纯化的藻蓝蛋白 ,使其在长波区 ( 61 6— 62 0 nm)吸收减小、荧光发射峰蓝移 ( 64 7nm→ 64 3nm) ;而变藻蓝蛋白不受影响 ,说明 Cu2 选择性作用于藻蓝蛋白。     

SMMC-7721肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体的分离纯化

分离纯化肝癌细胞的 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR) ,以便进一步研究 6 7LR的结构、功能及其在肝癌浸润、转移过程中的作用 .以SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞为材料 ,采用13 1I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力 ;亲和层析法分离纯化层粘连蛋白受体 ,用SDS PAGE、放射自显影及体外竞争结合实验进行鉴定 .在相同条件下SMMC 772 1肝癌细胞与层粘连蛋白特异结合量为 17 5 4± 0 4 9ng 10 5细胞 ,而L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白的特异结合量为 8 36± 0 4 8ng 10 5细胞 .经过亲和层析 ,从SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞均可获得纯化受体 ,SDS PAGE显示为单一条带 ,分子量为 6 7kD ,放射自显影及体外竞争结合实验表明其具有较强的与层粘连蛋白结合的活性 .体外竞争结合实验表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞层粘连蛋白受体 (772 1LnR)的抑制率可达到 96 2 7± 2 2 9% ,而L 0 2正常肝细胞层粘连蛋白受体 (L 0 2LnR)的抑制率为 4 8 71± 3 79% ,这说明 772 1LnR与层粘连蛋白的亲和力明显高于L 0 2LnR(P <0 0 0 1) .结果表明 ,与L 0 2肝细胞比较 ,SMMC 772 1肝癌细胞具有与层粘连蛋白较强结合能力的特异受体 ,并从肝癌细胞膜上分离纯化到与层粘连蛋白有较强亲和力的 6 7LR     

大肠癌及癌旁粘膜中CD_(44)、nm23-H_1的表达及其临床病理意义

探讨 CD44 、nm2 3- H1 的表达与大肠癌侵袭及转移的关系。应用免疫组化 SABC法检测 5 7例大肠癌组织及相应的癌旁粘膜、正常粘膜组织中 CD44 v6 、 CD44 S、 nm 2 3- H1 的表达 ,并分别比较其与大肠癌侵袭及淋巴结转移的关系。结果显示大肠癌组织 CD44 v6 的阳性率 (70 .18% )显著高于癌旁粘膜 (阳性率为 12 .0 2 % )及正常粘膜 (阳性率为 0 ) (P<0 .0 5 ) ;大肠癌组织 CD44 S和 nm2 3- H1 的阳性率 (分别为 42 .11%和 5 4.39% )显著低于癌旁粘膜 (分别为 89.47%和 91.2 3% )及正常粘膜(分别为 10 0 %和 94.74% ) (P<0 .0 5 )。CD44 v6 、nm2 3- H1 的表达与大肠癌浸润深度及淋巴结转移有相关性 (P<0 .0 5 ) ,与大肠癌分化程度无关 (P>0 .0 5 )。CD44 v6 与 nm2 3- H1 蛋白表达无明显相关性 (rs=- 0 .117,P>0 .0 5 )。结果表明 CD44 、nm2 3-H1 可作为大肠癌侵袭与淋巴结转移的重要标志     

天然免疫限制因子Tetherin的抗病毒机理研究进展

天然免疫限制因子Tetherin(骨髓基质细胞抗原2)是Ⅰ型干扰素诱导产生的Ⅱ型跨膜蛋白.Tetherin通过其特殊的拓扑结构,在病毒出芽过程中将病毒粒子连接在细胞膜表面,限制病毒的有效释放,从而发挥广谱性的抗病毒活性,而病毒也可以通过多种策略拮抗Tetherin的抗病毒活性.病毒与宿主长期抗争进化的结果表现为病毒特定拮抗蛋白对抗不同种属细胞Tetherin的限制存在种属特异性.本文通过对Tetherin的分子结构、抗病毒活性及其拮抗蛋白的对抗机制等最新进展进行综述,为研究病毒与宿主相互作用的分子机制以及新型抗病毒药物的筛选提供借鉴.     

美洲商陆抗真菌蛋白转化烟草的研究和抗病性检测

本研究为美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因首次对植物遗传转化的研究,转入烟草中研究此蛋白对烟草立枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转染烟草获得了大量再生转基因植株。PCR、Southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中,并且已经得到转译。转基因植株苗期抗立枯病试验表明,转基因烟草植株对立枯丝核菌表现出了抗性。