小鼠β-酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺的表达

为验证克隆的小鼠β－酪蛋白基因序列调控外源基因表达的能力,将人人t-PA突变体基因的信号肽－前肽编码序列用小鼠β－酪蛋白的信号肽编码序列替换,人t-PA突变体成熟肽cDNA融合到小鼠β－酪蛋白基因的第2外显子中,从而构建成旨在应用小鼠β－酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺中表达的载体。融合基因经显微注射到小鼠的受精卵中,285枚注射的受精卵移植到13只受体小鼠,经PCR和Southern杂交鉴定,42只出生小鼠中有12只为转基因阳性鼠。7只转基因阳性鼠乳汁中表达人t-PA突变体,最高表达水平为3．6593μg/ml,证明小鼠β－酪蛋白基因序列能够调控人t-PA突变体基因在转基因小鼠的乳汁中表达出具有生物活性的人t-PA突变体,为进一步制备了人t-PA突变体基因敲入小鼠模型提供了理论和实验依据。     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子Ⅸ（human clotting factor Ⅸ,hFⅨ)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子1、内含子1、外显孔子2共约6.7kb片段以及hFLX全长cDNA序列和部分经改造的内含子1的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠（9♂,3♀）,整合率为11.2%,经ELISA和Western blot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFⅨ的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%,FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合小鼠的不同染色体上,结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFⅨ基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFⅨ的生物活性。     

利用烟草表达人凝血Ⅸ因子(hFIX)的研究

血友病B是凝血Ⅸ因子(hFIX)缺乏所导致的一种出血性疾病,通过输血和hFIX浓缩剂进行治疗疗效显著,但存在治疗费用高和安全隐患,因而获得安全、廉价的人凝血Ⅸ因子对血友病B治疗具有重要意义.植物系统表达外源蛋白在生产成本和安全性方面具有优势.为此,构建含人凝血Ⅸ因子基因(hFIX,2.8kb)植物双元表达载体p35s-2300∷gus∷noster,用农杆菌介导法转化烟草"百日红",通过PCR和Southern blot分析证实获得4株独立转基因植株,hFIX在转基因烟草基因组中的拷贝数为1～4个;RT-PCR和ELISA检测结果表明,hFIX在转录和翻译水平已成功表达,hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2.5～8.8ng/g·FW,并具有免疫活性.为利用植物系统表达hFIX的后续研究作了必要准备,也为利用植物系统表达其他药用蛋白研究提供了一些理论和实验参考.     

人凝血Ⅸ因子cDNA在培养细胞中和转基因小鼠内的表达特性

将由ＳＶ４０早期启动子和小鼠金属硫蛋白基因启动子所控制的人凝血Ⅸ因子ｃＤＮＡ的重组基因分别导入培养的小鼠成纤维细胞,发现它们都能被表达。进而将它们分别导入小鼠受精卵雄原核,作成相应的转基因小鼠,则发现它们都失去了表达特性,结果分析表明,在人凝血Ⅸ因子ｃＤＮＡ中可能存在着决定其在活体内表达的顺式调节元件。     

牛α—sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达

将包括α－sl酪蛋白基因的启动子、LAtPA小基因、α－sl酪蛋白基因下游调控序列的融合基因经显微注射至小鼠的受精卵中,获得了5只转基因阳性鼠,其中1只转基因阳性雌鼠乳清中LAtPA的含量为0．18αg/ml,说明构建的LAtPA小基因能够正确表达出有生物活性的LAtPA, 在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠乳汁中表达。     

利用烟草表达人凝血IX因子(hFIX)的研究

血友病B是凝血IX因子(hFIX)缺乏所导致的一种出血性疾病,通过输血和hFIX浓缩剂进行治疗疗效显著,但存在治疗费用高和安全隐患,因而获得安全、廉价的人凝血IX因子对血友病B治疗具有重要意义。植物系统表达外源蛋白在生产成本和安全性方面具有优势。为此,构建含人凝血IX因子基因(hFIX,2.8kb)植物双元表达载体p35s2300∷gus∷noster,用农杆菌介导法转化烟草“百日红”,通过PCR和Southernblot分析证实获得4株独立转基因植株,hFIX在转基因烟草基因组中的拷贝数为1～4个;RTPCR和ELISA检测结果表明,hFIX在转录和翻译水平已成功表达,hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2.5～8.8ng/g·FW,并具有免疫活性。为利用植物系统表达hFIX的后续研究作了必要准备,也为利用植物系统表达其他药用蛋白研究提供了一些理论和实验参考。     

牛α-sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达

将包括α－ｓｌ酪蛋白基因的启动子、ＬＡｔＰＡ小基因、α－ｓｌ酪蛋白基因下游调控序列的融合基 因经显微注射至小鼠的受精卵中,获得了５只转基因阳性鼠,其中１只转基因阳性雌鼠乳清中 ＬＡｔＰＡ的含量为０．１８μｇ／ｍｌ,说明构建的ＬＡｔＰＡ小基因能够正确表达出有生物活性的ＬＡｔＰＡ, 并且可在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠的乳汁中表达。     

利用烟草表达人凝血IX因子 (hFIX)的研究

血友病B是凝血IX因子（hFIX）缺乏所导致的一种出血性疾病,通过输血和hFIX浓缩剂进行治疗疗效显著,但存在治疗费用高和安全隐患,因而获得安全、廉价的人凝血IX因子对血友病B治疗具有重要意义。植物系统表达外源蛋白在生产成本和安全性方面具有优势。为此,本研究构建含人凝血IX因子基因（hFIX,2.8kb）植物双元表达载体p35s-2300：：gus：：noster,用农杆菌介导法转化烟草 "百日红",通过PCR和Southern blot分析证实获得4株独立转基因植株, hFIX在转基因烟草基因组中的拷贝数为1-4个;RT-PCR和ELISA检测结果表明,hFIX在转录和翻译水平已成功表达,hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2.5~8.8ng/g·FW,并具有免疫活性。本研究为利用植物系统表达hFIX的后续研究作了必要准备,也为利用植物系统表达其他药用蛋白研究提供了一些理论和实验参考。     

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子l、内含子1、外显子2共约6.7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子l的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠(9♀,3♂),整合率为11.2%.经EuSA和western b1ot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%.FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上.结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFIX的生物活性.     

牛β-酪蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建

利用PCR技术分3段克隆了长约9．7kb的牛β-酪蛋白基因,分别克隆在pGEM-T easy Vector的T位点。经NCBI Blastn分析,与牛β-酪蛋白基因相应区段的同源性为98％。这3段序列包含完整的5’侧翼序列、前8个外显子及第8个内含子的部分序列。以此构建了两个乳腺特异性表达载体：利用第1段和第2段共有的酶切位点将两段融合,作为5’调控区（6．8kb）,第3段和实验室已有的600bp的加尾信号通过重组PCR拼接作为3’调控区（3．4kb）构建了一乳腺特异性表达载体;以第一段作为5’调控区,实验室已有的600bp加尾信号作为3’为调控区构建了另一乳腺特异性表达载体。可以应用于进一步乳腺生物反应器的研制。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β－乳球蛋白基因（BLG）作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工龄,构建了组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,以PCR和Southern-Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG－tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汗中检测到tPA r itd ntg ,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合的小鼠基因组中的牛BLG－tPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

转基因小鼠乳腺表达人胰岛素基因的研究

转基因动物乳腺生物反应器表达和生产医用蛋白是国际上的研究热点,目前已有很多成功的转基因动物乳腺表达出外源蛋白质［１］。在转基因动物乳腺表达的蛋白质包括凝血因子Ⅸ、组织纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）、α１抗胰蛋白酶原、白介素２、蛋白质Ｃ、超氧化物歧化酶...     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1-β6.7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT－PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果：构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。说明构建具有较长5'端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。     

尖体注射导入的人生长激素融合基因在小鼠乳腺中的暂态表达

以牛asl－酪蛋白基因的5′端及上游区3．4kb和3′端及下游区3．5kb作为调控元件,以人生长激素基因作为报告基因构建了融合基因,通过乳腺,心脏注射到小鼠体内,利用放射免疫分析方法（RIA）在泌小鼠的乳汁中检测到了表达的人生长激素,表明融合基因的构建是正确的。并由此建立了通过靶组织注射结合心脏注射对融合基因的构建无地自容伯快速简便方法,其中通过心脏注射而于乳腺获得特异性表达的实验结果尚未见报道。     

人转化生长因子β1在大肠杆菌中的表达——Ⅰ.胞内直接表达

采用PCR技术 ,扩增了人转化生长因子β1 (hTGFβ1 )成熟肽基因 ,并对其进行了全序列测定 .采用DH5α/ pBV2 2 0表达系统 ,使TGFβ1在大肠杆菌胞内的表达达到 1 6 % .通过N端氨基酸序列测定和免疫印迹分析 ,证实重组蛋白为hTGFβ1单体蛋白 .采用谷胱甘肽法或CHAPS/DMSO法 ,使重组蛋白的复性率达到 30 % .通过纯化获得了银染一条带的重组蛋白 ,MTT法对Mv1Lu细胞的测活表明 ,重组蛋白具有较强的生物活性     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。     

拟南芥6个酪蛋白激酶基因的组织表达及其生物信息学分析

利用实时荧光定量PCR技术研究6个酪蛋白激酶基因在不同组织中的表达特性.结果表明:6个基因在各个器官中均有表达,但表达量不同.AT4G14340、AT3G23340、AT1G03930和AT3G03940基因在花中表达量最高,在根中其次,在茎、叶和叶柄中的表达量最低;A T1G04440和AT4G26100基因在根中的...