一种基于寡核苷酸微阵列芯片的多重可扩增探针杂交技术

多重可扩增探针杂交技术(multiplex amplifiable probe hybridization,MAPH)是近年来发展起来的一种用于基因组中DNA拷贝数检测的新技术。并发展了一种基于寡核苷酸微阵列芯片的MAPH技术。该方法根据所检测的DNA序列,制备若干具有通用引物的FCR产物作为可扩增探针组,与固定在尼龙膜上待测的基因组DNA杂交。用磁珠回收特异性杂交的探针,经生物素标记的通用引物扩增后,与相应的寡核苷酸微阵列芯片杂交。该特异性的寡核苷酸微阵列芯片包括10个抗肌营养不良基因的外显子探针和阴性、阳性探针。杂交清冼后,链霉亲和素-Cy3染色用芯片扫描仪得到杂交的荧光图像。分析荧光信号的强度差异给出特定基因片段拷贝数的变化。该方法用微阵列技术代替MAPH中的电泳检测技术,可大幅度增加检测的通量。选择了一个正常男性、一个正常女性和一个肌营养不良症患者的基因组DNA来进行验证。结果表明,该方法能够同时给出抗肌营养不良基因多个外显子中的基因片段拷贝数差异信息。     

基因工程

通过熔解待测DNA,将24个碱基的寡核普酸引物与连有1.okb片段的单DNA序列退火,并用DNA聚合酶完成链延伸反应,来扩增1.Okb的DNA专一性探针片段。从理论上说,要增工00 000 000倍,需要重复此过程25次。扩增之后,将反应混合物转移到尼龙过滤器中,并用点印迹法与放射性标记的1.Okb片段杂交。用     

纳米金基因芯片结合通用PCR同时检测多个病原性真菌

基于致病性真菌rDNA基因分型技术,构建采用通用引物的一次PCK法,并结合纳米金新型基因芯片检测系统实现一次对多个临床常见致病性酵母菌的检测分析.用生物素标记的通用引物扩增各真菌DNA片段并与基因芯片杂交,然后将链酶亲和素标记的纳米金结合到杂交体上,杂交信号通过银染反应被放大形成裸眼可见的显色信息.结果表明,通用引物可扩增临床常见的真菌DNA,选用的各探针特异性强、可靠性好,芯片的最低检测值达50 fmol/L.临床样品检测结果与常规鉴定方法结果一致.该技术检测时间短、操作简单、不需要特殊设备,能部分满足临床检测的通量要求,具有很好的临床应用前景.     

问号钩端螺旋体基因组DNA芯片的研制

目的 研制并初步评估问号钩端螺旋体(简称钩体)赖型赖株的基因组DNA芯片。方法 利用Primegens引物设计软件筛选出问号钩体赖型赖株全基因组中的特异性基因进行引物设计。对成功设计出相应引物的3 290个基因用聚合酶链反应方法进行扩增,以纯化后的产物点样制备芯片。并用双色荧光杂交策略对芯片质量进行了初步平估。结果 共获得3 290个基因产物用于点样。参考株自身杂交实验结果表明:该芯片有较高的点一致性、信噪比和较低的假阳性率。结论 成功制备了包含问号钩体赖型赖株3 290个目的基因的基因组DNA芯片,并可用于基于该芯片的问号钩体比较基因组学的研究。     

寡核苷酸DNA Microarray用于HLA DRB1基因分型的研究

对寡核苷酸DNA Microarray用于HLA DRB1基因分型的技术进行研究。常规的酚/氯仿法提取标准血样基因组DNA,在DRB1的exon2区域设计一对引物,经PCR扩增基因组相应区段并用Cy5-dCTP进行标记。设计寡核苷酸分型探针,将探针固定在APS-PDC法制作的DNA Microarray上,用标记的PCR产物与之杂交,扫描仪对杂交效果进行扫描,Imagene软件对杂交图像进行分析。共检测了33例标准血样的HLA DRB1基因型。检测结果证明研制的DNA Microarray准确、灵敏。DNA Microarray技术可以有效地检测DRB1等位基因,对比常规的PCR-SSP和PCR-SSO方法、分型基因芯片方法更为直观,并有集成化优势。     

高产王浆西蜂DNA分子中的相关基因标志筛选及其鉴定

为了探讨西蜂与高产王浆相关特异基因标记 ,用 12种随机引物 (P1～P12 )对产王浆量不同的4品系西蜂的基因组DNA进行了RAPD PCR分析 ,分别获得了产王浆量高、低不同西蜂的DNA多态性图谱 ,并从P2 引物的DNA多态性图谱中筛选出一差异DNA片段P2 316bp .将P2 316bp差异DNA片段用地高辛标记制备成探针 ,进行Southern杂交鉴定 .实验显示 ,探针与高产王浆西蜂基因组DNA的扩增产物出现了阳性杂交信号 ,而与低产王浆西蜂基因组DNA的扩增产物未出现阳性杂交信号 .结果表明 ,该差异性基因片段P2 316bp是西蜂高产王浆优良性状相关的遗传标记 ,序列为 30 5个核苷酸 .     

基因重组与基因合成实验设计软件系统的建立

本文报导了用于基因重组与基因合成实验设计的软件系统的建立.此系统由30个功能模块组成,为研究者提供了包括在DNA分子上寻找限制性内切酶位点、核酸分子片段之间同源性比较,基因化学合成的实验设计、特定顺序分析引物及核酸杂交探针的设计、阅读框的查找等功能.此外,本系统可以对外来数据库的资料进行援引和进一步分析,为分子生物学的研究提供有价值的信息.     

任意引物PCR及其应用研究进展

任意引物PCR技术又称为随机扩增多态性DNA技术,它是在PCR技术基础上发展起来的一项分子检测技术。它具有简便、快速,一套引物可用于多个物种的分析,不需预知分析对象的核酸序列,可以显示差异表达基因等特点,已广泛应用于病原微生物的分型鉴定、物种亲源关系分析、遗传育种研究和特异表达基因的克隆与鉴定等方面。     

转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化北大核心CSCD

对甘蔗Southern杂交体系的优化,旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料,就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面,对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。结果表明,改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求;PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高,更适合用于Southern杂交;40μg的DNA在400μL酶切体系中,酶切10 h可获得良好的酶切效果;杂交温度40℃,杂交18 h,可获得清晰的杂交条带。     

穿山甲标本和甲片的DNA提取及PCR扩增

为验证经处理后的穿山甲(Manis spp.)标本和甲片是否可以用于种间分子鉴定标记的开发及个体识别工作,本文在样品的预处理、消化、提取后纯化等方面对传统提取方法进行了改进,分别从穿山甲剥制标本、干皮标本及甲片中提取总DNA;然后用Cyt b基因扩增通用引物、12S rRNA基因全序列扩增引物、RAPD引物及微卫星引物进行了PCR扩增,并对部分扩增结果进行了序列测定.结果表明,除剥制标本的脚底皮张组织外,其他样品基本都可以提取出DNA.以此为模板的PCR扩增中,2种线粒体基因引物扩增出明显目的条带,RAPD引物扩增出种间特异条带,测序结果可用于种间特异性引物及SCAR引物的开发;微卫星引物在甲片样品中扩增稳定,可用于个体识别工作.     

转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化

对甘蔗Southern杂交体系的优化,旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料,就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面,对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。结果表明,改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求;PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高,更适合用于Southern杂交;40μg的DNA在400μL酶切体系中,酶切10 h可获得良好的酶切效果;杂交温度40℃,杂交18 h,可获得清晰的杂交条带。     

DNA芯片及其在生命科学中的应用

对DNA芯片的发生、发展、技术特点及在生命科学中的应用作了回顾,结果表明DNA芯片通过DNA或RNA样品与阵列的的杂交,可用于基因测序、基因表达、新基因的发现、突变的检测等等领域,虽然DNA芯片目前存在着不足和缺陷,但它正成为基因组和后基因组研究的重要工具.     

一种测定癌基因c-Ha-ras点突变的简易方法——PCR-RFLP法

利用多聚酶DNA链延伸反应与限制性内切酶酶解片段长度多态性分析相结合,可简单、迅速、准确地对胃癌组织及细胞株DNA中癌基因c-Ha-ras第12位密码子是否存在点突变进行测定。这个方法是使用非同位素方法对单拷贝基因点突变进行检测的首次报道。     

PCR 芯片及其应用研究进展

PCR芯片实质上就是固定有与研究对象有关的许多已知基因的引物阵列并可用于PCR检测的固相载体,其制作时最关键的是目的基因的引物设计。与基于杂交的芯片技术不同,PCR芯片技术是一种高通量的,准确、灵敏的定量检测基因表达的技术,它将待测基因的引物固定于固相载体上,通过简单的、经过优化的定量PCR体系和荧光定量PCR仪,实现待检样品中已知基因的扩增,用于定量检测待检样品中已知基因的表达情况。PCR芯片由于其操作简单、结果准确、数据产出快而多等特点,已应用于疾病发病机制、药物作用机理和细菌分型等研究领域,并将在生命科学研究领域得到更为广泛的应用。     

核酸诊断技术规范化的研究

针对PCR技术应用中的一些问题,从下述几方面开展了核酸诊断技术标准化的研究:①探讨了设计引物的影响因素,发现根据同一基因设计的不同引物对PCR敏感性影响较大,可相差20倍,进一步研究表明,引物的自由能,尤其是引物3'端6个碱基的自由能可能决定着PCR的敏感性;②研制成功室温稳定的PCR试剂,将所有PCR成分(加入一种酶保护剂)配制并分装于微量离心管中,并干燥,试剂室温放置8个月,37℃破坏2周对检测结果无任何影响;③因尿嘧啶糖基化酶(UDG)可特异降解DNA双链中的尿密啶核苷,PCR体系中以dUTP代替dTTP,并在PCR扩增前用UDG消化15 min,就可以特异防止PCR产物的污染.对炭疽杆菌、鼠疫杆菌、土拉杆菌和布鲁氏菌扩增结果表明,0.1 U的UDG可完全消化103～108个产物分子的污染;④建立了微孔板杂交技术代替电泳方法检测扩增产物,将PCR产物克隆作为捕获探针包被聚乙烯微孔板,PCR引物5'末端生物素标记,扩增后作为待检测探针杂交,通过比较影响微孔板杂交的包被、杂交和显色等因素,建立了PCR-EIA技术.通过比较包被缓冲液发现镁离子及其离子强度是影响DNA包被的重要因素,包被的DNA以线型质粒最佳,每孔包被300ng左右的DNA 杂交效果最好;杂交液中加和不加甲酰胺对杂交影响不大;用链霉亲和素化的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶酶联显色均能达到检测杂交体的目的,但前者显色较快,更为实用.确定了PCR-EIA技术的最佳的包被、杂交和显色的条件,比常规的PCR-电泳检测敏感性高10倍;⑤比较了不同标本处理方法,确定了各种临床标本和动物组织的较为理想的处理方法.通过上述不同方面的研究,确定了从引物设计、试剂配制、标本处理、UDG防污染和产物微孔板杂交-酶联显色检测等方面的优化条件,建立起敏感性高、特异性强、操作简便和检测客观的核酸检测技术,为临床实验室的常规应用和反生物战病原微生物的核酸诊断奠定了基础.     

PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分

以鸭肌肉组织DNA为模板,利用PCR-mtDNA技术成功克隆出了鸭mtDNA COIII基因(GenBank Accession No.DQ655706).对所克隆的序列分析表明.其序列包括鸭细胞色素C氧化酶III(COIII)基因全序列784 bp,通过同源性分析可知,动物的线粒体DNA COIII基因是相对保守的,利用此特性设计PCR-mtDNA方法鉴别检测鸭源性成分的特异性引物;以各种动物肌肉组织及饲料DNA为模板进行PCR扩增、经反复验证筛选出只能扩增出鸭DNA的目的片段,而不能扩增出其他动物DNA片段的特异性强、稳定性好的引物P3、P4;利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226 bp,对PCR产物进行测序分析可知与已克隆的鸭mtDNA COIII基因同源性达到100%,证明了所筛选引物的准确性.通过对不同含量的DNA模板溶液进行PCR扩增的方法,对筛选出的特异性引物P3、P4进行灵敏度试验,结果分析表明灵敏度约为0.001%,证明该PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,完全可作为鉴别不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分的方法.     

落羽杉属树木基因组总DNA的提取及SRAP反应体系的优化

本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,对其基因组DNA提取方法进行研究,比较了SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组DNA的效果,结果表明:CTAB法提取效果较佳.在此基础上,利用正交设计法,对SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶进行了优化筛选,确立了适合落羽杉属植物SRAP-PCR反应的最佳体系,即10 μL体系中含有1 μL10×PCR buffer,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP 100 μmol/L,引物0.3 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U和50 ng模板DNA.利用该优化体系,通过48对SRAP引物组合对2个落羽杉属植物(落羽杉和墨杉)及4个杂交后代进行SRAP扩增,结果发现,SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究.     

小麦农家品种红麦(京2747)主效抗条锈病基因的RAPD标记

小麦农家品种红麦(京2747)可抗中国小麦条锈菌多个生理小种。遗传分析表明,该品种对于小麦条锈菌条中19号生理小种的抗性由1对显性基因控制。本研究采用铭贤169×红麦的F2分离群体建立抗、感DNA池,用RAPD方法进行DNA多态性分析。共筛选236个10碱基随机引物,其中引物S1167所扩增出的1条约245 bp的多态性DNA片段只出现在抗病DNA池和红麦中,而不出现在感病DNA池和感病品种铭贤169中。经用201株杂交F2植株对多态性DNA片段S1167245与目的基因的遗传连锁性进行分析,在164株抗病单株中有156株可稳定扩增出该特异DNA片段,而在37株感病单株中则有34株不能扩增出该特异DNA片段,经统计共有11株发生了交换,标记S1167245与目的抗病基因间的遗传距离为6.1cM。本研究得到的RAPD标记S1167245表现稳定、重复性强,可用于小麦抗锈育种中的标记辅助选择,促进红麦的抗条锈基因的利用。     

DNA在鸟类分子系统发育研究中的应用

鸟类分子系统发育研究中常用的DNA技术有DNA杂交、RFLP和DNA序列分析等。DNA杂交技术曾在鸟类中有过大规模的应用,并由此诞生了一套新的鸟类分类系统。在鸟类的RFLP分析中,用的最多的靶序列是线粒体DNA。DNA序列分析技术被认为是进行分子系统发育研究最有效、最可靠的方法。在DNA序列分析中,线粒体基因应用最广泛,但由于其自身的一些不足,近年来,不少学者把目光投向了核基因,将线粒体基因和核基因结合起来进行系统发育研究。目前在鸟类分子系统发育中,应用较多的核基因是scnDNA,其内含子可以用于中等阶元水平的系统研究,而外显子主要用于高等阶元的系统研究。除了分子标记自身的问题之外,鸟类分子系统发育研究中还存在着方法上的问题,包括分子标记的选择,样本数量以及数据处理等。今后鸟类分子系统发育研究应该更加注重方法的标准化。     

基于专化的反转录转座子序列开发鉴定簇毛麦染色质的PCR分子标记

通过克隆簇毛麦的专化序列,开发基于其序列的可用于鉴定簇毛麦染色质的PCR分子标记.用根据抗病基因保守域设计的XLS和A3简并引物进行PCR,检测到1条簇毛麦的特异PCR产物,酶切分析与测序结果表明:这条特异带由4类不同的片段组成,且都与反转录转座子具有同源性.以其中1个片段pHv29为探针进行Southern杂交,发现只有含有簇毛麦染色质的材料产生强的杂交信号,表明pHv29是一个对簇毛麦专化的反转录转座子序列.根据pHv29序列重新设计1对特异引物pHv29-F和pHv29-R,用一系列含有簇毛麦染色质的易位系或添加系的基因组DNA为模板进行PCR扩增,电泳结果表明pHv29433可以作为鉴定簇毛麦的染色质的分子标记.