人Sema4C重组腺病毒载体的构建及其在小鼠成肌细胞系C2C12中的表达

利用Ad5腺病毒载体系统构建人Sema4C基因重组腺病毒表达载体并在成肌细胞系C2C12中表达,并初步探讨Sema4C基因在成肌发育过程中的可能作用。利用脂质体介导重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装出完整的腺病毒;将重组腺病毒载体感染C2C12成肌细胞后,利用激光共聚焦显微镜观察发现12h即有绿色荧光表达,24h后绿色荧光蛋白表达最强;流式细胞仪检测病毒的感染效率几乎达100%。WB检测结果表明感染重组腺病毒载体组C2C12细胞Sema4C蛋白的表达量明显高于空载体对照组（P<0.01）。为了进一步观察Sema4C基因对C2C12细胞增殖分化的影响,流式细胞仪检测了病毒感染48h后C2C12细胞的增殖指数,并对感染后诱导分化的C2C12细胞的分化情况进行了观察。我们的结果首次表明,过表达外源性人Sema4C基因不仅能使C2C12细胞的G0/G1期比例增加,细胞的增殖指数下降,同时在分化培养条件下还能促进C2C12细胞肌管的形成。     

狗凝血Ⅸ因子cDNA的克隆及其离体表达研究

根据cFⅨcDNA(canineFⅨ ,cFⅨ )顺序设计引物 ,采用RT PCR技术 ,从狗肝细胞中提取mRNA ,逆转录成cFⅨcDNA ,克隆到pGEM T质粒载体上 ,经DNA顺序分析 ,挑选克隆 ,拼接并测序鉴定 ,得到DNA顺序完全正确且含有cFⅨ完整编码区的cDNA ,进一步构建成以G1Na为框架的反转录病毒载体G1NaCcⅨ (hCMV启动子控制cFⅨ转录 )和G1NaMBcⅨ (MCK增强子和β actin启动子共同控制cFⅨ转录 ) ,并用于反转录病毒介导的基因转移 .狗原代皮肤成纤维细胞实验结果显示 ,cFⅨ能够在狗皮肤成纤维细胞中表达 ,表达水平分别为G1NaCcⅨ :173ng/ 10 6 细胞·2 4h ;G1NaMBcⅨ :2 11ng/ 10 6 细胞·2 4h .此结果为血友病B狗基因治疗动物试验的开展奠定了基础 .     

Egr1对小鼠成肌细胞C2C12分化的影响

早期生长反应蛋白1(early growth response protein 1,Egr1)作为转录因子在细胞增殖、分化及凋亡等许多生物学过程中都扮演着重要角色,但是其对小鼠成肌细胞C2C12分化的影响尚不明确。该研究采用Western blot和免疫荧光技术检测Egr1在C2C12细胞分化过程中的表达规律及定位。利用CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9技术分别激活和抑制Egr1的表达,进而探讨Egr1对C2C12细胞分化的影响。结果显示,随着C2C12细胞分化的进行,Egr1的表达量在分化的第5 d达到峰值,随后呈下降趋势。Egr1表达定位于C2C12的细胞核与细胞质中,随着分化的进行,其在细胞核和细胞质中的表达量均显著升高。分别激活或抑制Egr1后,C2C12细胞肌管融合率以及肌肉分化标志分子肌细胞生成蛋白(myogenin,MYOG)和肌球蛋白重链2(myosin heavy chain 2,MYH2)水平均显著增加或降低。该研究结果表明,Egr1能够促进体外小鼠成肌细胞C2C12的分化。     

低氧抑制C2C12细胞的体外分化

目的:研究低氧环境对C2C12细胞分化的影响,为探讨肌肉的发生和骨骼肌的损伤修复机理提供理论依据.方法:培养C2C12细胞,分别在常氧和低氧(3%O2)条件下诱导分化.免疫细胞化学方法检测成肌细胞终末分化的标志蛋白MI-IC(肌球蛋白重链)的表达;Western blot检测MHC以及MRFs(成肌调控因子)的表达.结果:在常氧条件下诱导分化的C2C12细胞融合形成肌管并表达MHC蛋白,而在低氧条件下培养的C2C12细胞几乎很少融合形成肌管并表达MHC蛋白;同时低氧下调了C2C12细胞中MRFs的表达.结论:低氧抑制了C2C12细胞的体外分化.     

腺相关病毒介导的小鼠Ⅸ因子在血友病B小鼠体内表达研究

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10¹²)的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒, 并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中, 获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370 ng/mL), 持续时间超过350 d. 治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30%, 而且出血症状得到显著改善. 在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体, 第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低. 重复注射AAV/mFⅨ病毒后, 不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果. 组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌. 以上结果显示, AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法.     

敲减DTX4表达抑制C2C12细胞成肌分化

DTX4（Deltex 4 homolog）蛋白属于Deltex家族成员|Deltex家族是Notch信号通路的调节因子. 已知Notch信号通路在成肌分化中发挥重要作用. 然而,DTX4是否参与调控肌肉发育尚未有报道. 本研究探索DTX4对成肌分化的影响及作用机制. 实时定量PCR和蛋白质印迹分析揭示,伴随小鼠C2C12成肌细胞（myoblast）分化为肌管（myotube）过程,成肌分化标志蛋白肌球蛋白重链（myosin heavy-chain,MyHC）、肌细胞生成素(myogenin)表达逐渐升高,DTX4 mRNA及蛋白质表达水平也逐渐升高. 通过顺序专一的siRNA敲减DTX4表达后,C2C12成肌细胞肌管面积和肌管融合指数明显减少|MyHC、肌细胞生成素蛋白表达水平明显降低|但ERK信号通路未见明显变化.上述结果表明,敲减DTX4表达抑制C2C12细胞成肌分化.我们的结果提示,DTX4可能参与C2C12细胞成肌分化.     

TNF-α对骨形成蛋白-2诱导的小鼠C2C12细胞向成骨细胞分化的影响及可能机制

目的:研究肿瘤坏死因子(TNF-α)对骨形成蛋白-2(BMP-2)诱导的小鼠成肌C2C12细胞向成骨细胞分化的影响并探讨相关的作用机制。方法:分别以TNF-α(5 ng/mL)和BMP-2(100 ng/mL)单独或联合处理小鼠成肌C2C12细胞,检测细胞中碱性磷酸酶(AKP)的活性;采用BMP-2 100 ng/mL联合不同浓度TNF-α(0、2、5、8、10 ng/mL)或TNF-α5 ng/mL联合不同浓度BMP-2(0、100、200、300 ng/mL)处理细胞,检测细胞中AKP的活性。蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞中Smad1和NF-κB磷酸化的水平。结果:与对照组相比,BMP-2(100 ng/mL)能显著增加C2C12细胞中AKP活性(P0.05),但TNF-α(5 ng/mL)可显著抑制C2C12细胞中AKP活性(P0.05)。C2C12细胞中AKP活性随着TNF-α浓度的增加显著降低(P0.05),但随着BMP-2浓度的增加而显著升高(P0.05)。与对照组相比,TNF-α能显著降低C2C12细胞中磷酸化Smad1的水平,且显著升高炎症相关因子NF-κB磷酸化水平,但加入BMP-2对NF-κB无显著影响。结论:TNF-α能抑制BMP-2诱导的C2C12细胞向成骨细胞分化,且具有一定的剂量效应,其作用机制可能与调控炎症相关因子NF-κB活性干预BMP2-Smad1信号通路有关。     

中胚叶叉头-1在骨成形蛋白-2诱导肌胚细胞C2C12转化成骨细胞过程中的作用

为了研究中胚叶叉头-1(MFH-1)基因在骨骼形成和细胞分化中的作用,利用基因重组、杂交瘤技术制作MFH-1单克隆抗体, 利用蛋白质印迹和RNA印迹分析观察了骨成形蛋白-2 (BMP-2)诱导小鼠肌胚细胞C2C12表达MFH-1、产生碱性磷酸酶和骨钙蛋白.小鼠肌胚细胞C2C12低水平地表达内源性MFH-1蛋白以及导入小鼠MFH-1 cDNA的人膀胱癌细胞HTB9也表达小鼠MFH-1蛋白,这种蛋白质定位于细胞核中.用BMP-2处理后, MFH-1蛋白和mRNA在C2C12细胞中的表达显著地增加.用反义MFH-1序列转染小鼠肌胚细胞C2C12可降低内源性MFH-1水平, BMP-2不能诱导导入反义MFH-1序列的肌胚细胞C2C12产生MFH-1蛋白,也不能诱导碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙蛋白量的增加.结果表明, BMP-2诱导的MFH-1蛋白在调节肌胚细胞C2C12向成骨细胞分化方面起关键作用.     

激活Shh信号通路促进BMP9诱导的小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化

近年来骨组织工程技术迅猛发展,小鼠成肌细胞C2C12因其来源广泛等优点可望成为有效的种子细胞应用于组织工程. 然而,对于C2C12细胞的成骨分化机制仍需深入研究. 为了观察Sonic hedgehog（Shh）信号通路对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic proteins 9,BMP9）诱导的C2C12细胞成骨分化的影响,构建过表达腺病毒Ad Shh,并作用于BMP9处理的C2C12细胞,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase , ALP）的变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT PCR检测Shh、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素（osteocalcin,OCN）、Runx2、Dlx5、Id1和Id2基因表达,Western印迹检测Shh、OPN、OCN、Runx2和Dlx5的蛋白质表达,Micro-CT和H&E染色检测裸鼠皮下异位成骨包块情况. 结果表明,活化Shh信号通路可促进BMP9诱导的C2C12细胞早晚期成骨分化,以及裸鼠皮下异位成骨.体内外实验证明,Shh信号通路能促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化.     

激活Shh信号通路促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化

近年来骨组织工程技术迅猛发展,小鼠成肌细胞C2C12因其来源广泛等优点可望成为有效的种子细胞应用于组织工程.然而,对于C2C12细胞的成骨分化机制仍需深入研究.为了观察Sonic hedgehog(Shh)信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的C2C12细胞成骨分化的影响,构建过表达腺病毒Ad-Shh,并作用于BMP9处理的C2C12细胞,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT-PCR检测Shh、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runx2、Dlx5、Id1和Id2基因表达,Western印迹检测Shh、OPN、OCN、Runx2和Dlx5的蛋白质表达,Micro-CT和HE染色检测裸鼠皮下异位成骨包块情况.结果表明,活化Shh信号通路可促进BMP9诱导的C2C12细胞早晚期成骨分化,以及裸鼠皮下异位成骨.体内外实验证明,Shh信号通路能促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化.     

腺相关病毒介导的小鼠IX因子在血友病B小鼠体内表达研究

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10~(12))的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒,并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中,获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370ng/mL),持续时间超过350d。治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30％,而且出血症状得到显著改善。在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体,第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低。重复注射AAV/mFⅨ病毒后,不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果。组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌。以上结果显示,AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法。     

敲除C3G对H9C2心肌细胞增殖及凋亡的影响

该研究构建了NT CRISPR/Cas9(阴性对照)及C3G CRISPR/Cas9质粒,分别将其包装成重组慢病毒,并感染H9C2心肌细胞,以研究敲除C3G(Crk SH3域结合鸟嘌呤核苷酸交换因子)对H9C2心肌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。将实验分为NT CRISPR/Cas9组、C3G CRISPR/Cas9组、NT CRISPR/Cas9低氧组和C3G CRISPR/Cas9低氧组。通过RT-PCR检测C3G m RNA的表达;Western blot检测相关蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示,C3G CRISPR/Cas9组和C3G CRISPR/Cas9低氧组的C3G m RNA和蛋白无表达;分别与NT CRISPR/Cas9组和NT CRISPR/Cas9低氧组比较,C3G CRISPR/Cas9组和C3G CRISPR/Cas9低氧组的p-ERK1/2和Bcl-2蛋白以及细胞增殖水平均降低(P0.05),Bax蛋白及细胞凋亡水平均增加(P0.05);与NT CRISPR/Cas9组相比,NT CRISPR/Cas9低氧组C3G m RNA和蛋白表达均降低(P0.05),p-ERK1/2和Bcl-2蛋白及细胞增殖水平均降低(P0.05),Bax蛋白及细胞凋亡水平均增加(P0.05);与C3G CRISPR/Cas9组相比,C3G CRISPR/Cas9低氧组的p-ERK1/2和Bcl-2蛋白及细胞增殖水平均降低(P0.05),Bax蛋白及细胞凋亡水平均增加(P0.05)。以上结果表明,敲除C3G能通过调控p-ERK1/2、Bcl-2及Bax抑制H9C2心肌细胞增殖并促进其凋亡。     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

miR-143-3p促进C2C12成肌细胞分化

MicroRNAs (miRNAs) 是一类小非编码RNA,近年研究发现其在骨骼肌发育调控中发挥重要作用.为探明miR-143-3p在C2C12成肌细胞分化中的调控作用,采用 real-time PCR 检测了miR-143-3p在小鼠各组织及C2C12成肌细胞分化过程中的表达;使用miR-143-3p 的模拟物和特异性抑制剂分别处理细胞,采用 real-time PCR 和 Western印迹分别检测成肌因子 MyoG和成肌标志基因 MyHC mRNA和蛋白水平的变化;用免疫荧光染色的方法观察肌管的形成.结果显示,miR-143-3p在小鼠各组织中均有表达,并且随着细胞分化表达量逐渐增加;C2C12成肌细胞过表达 miR-143-3p,与对照组相比,成肌调控因子MyoG和成肌标志基因MyHC 的mRNA和蛋白表达均显著升高,肌管数量明显增多;抑制剂处理结果显示,细胞分化被显著抑制.检测miR-143-3p对MyHC各亚型表达的影响发现,miR-143-3p表达的变化并不直接影响MyHC各亚型的表达.以上结果说明, miR-143-3p在骨骼肌和成肌细胞中均有表达,能够促进C2C12成肌细胞分化,但并不直接调控MyHCs的表达.     

过表达Runx2促进C2C12细胞成骨分化

利用Tet-on(Tetracycline-on)基因表达系统,通过强力霉素(doxycycline,DOX)诱导Runx2基因在C2C12细胞中的表达,探究Runx2促成骨分化功能,为其分子机制的研究提供一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-Flag-Runx2转染入C2C12细胞,并用G418和潮霉素分别进行2轮筛选,运用实时荧光定量PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度DOX诱导C2C12/Tet/pTRE-Flag-Runx2细胞,蛋白免疫印迹检测Runx2的表达,确定DOX的最佳诱导浓度与时间,并检测C2C12细胞的成骨分化能力.结果表明,诱导细胞最佳DOX浓度为10μg/ml;最佳诱导时间为12h;诱导后Runx2基因高表达,C2C12细胞向成骨方向分化(P0.05).成功建立Tet调控Runx2基因表达C2C12细胞系,为进一步研究Runx2基因功能分子机制提供理想的细胞模型.     

干扰Sirt2促进C2C12成肌细胞分化

Sirt2是组蛋白去乙酰化酶(HDAC III)家族成员之一, 对细胞周期、自噬、脂肪细胞分化、神经细胞存活等生物学过程的调节发挥重要作用. 目前,Sirt2在肌肉发育过程中的研究尚未见报道.本文通过构建Sirt2慢病毒干扰载体,侵染C2C12成肌细胞,并用细胞免疫荧光化学、real-time PCR 和Western印迹方法,检测其对成肌分化标志基因及相关信号通路因子的影响. 结果显示,干扰质粒shRNA 663处理C2C12细胞后,Sirt2 mRNA及蛋白质表达水平与对照相比显著下调(P<0.01);C2C12细胞分化第4 d,MyoD,MyoG,MyHC mRNA及蛋白质表达均显著增加(P<0.01); PI3K,AKT,FoxO1磷酸化水平明显升高. 结果表明,Sirt2可通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路来促进成肌细胞分化,是肌生成的一个潜在调节因子.     

重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析。MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白（GFP）表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度。结果成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E＋8 TU/mL。结论本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础。     

干扰Sema7A抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化

为研究脑信号蛋白家族（Semaphorins）成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,用此siRNA转染C2C12成肌细胞．通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,real-time qPCR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,C2C12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高．免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHC+细胞所占比例均显著降低．Real-time qPCR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA及蛋白质表达均下降．进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调．以上结果表明,Sema7A可以调节C2C12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.     

低糖应激对成肌细胞增殖的影响及其机制

利用小鼠骨骼肌成肌细胞系(C2C12)作为细胞模型,通过检测低糖应激对C2C12成肌细胞增殖、细胞周期分布、线粒体功能、去乙酰化酶1(sirtuin1,SIRT1)及其下游基因m RNA表达的影响,探讨低糖应激对成肌细胞增殖影响及其机制。研究发现,低糖应激(5 mmol/L)第3 d导致C2C12成肌细胞增殖下降(P0.01)、细胞周期停滞于G0/G1期、活性氧和线粒体膜电位显著性降低;低糖应激也增加了线粒体ATP(adenosine triphosphate,ATP)合成(P0.05),同时促进了SIRT1、FOXO3a(forkhead box O3a)、p27(p27/Kip1)m RNA表达(P0.05)。结果表明,低糖应激可能经SIRT1/FOXO3a轴上调p27 m RNA表达,促使增殖活性下降和细胞周期停滞G0/G1。同时,低糖应激也提升了成肌细胞线粒体能量代谢的高效性。     

CVB3诱导的急性心肌炎C57BL/6小鼠模型转录组分析

研究柯萨奇病毒B3(CVB3)感染小鼠所引起的心肌组织转录组变化规律.C57BL/6小鼠腹腔接种浓度为104TCID50的CVB3,建立C57BL/6急性病毒性心肌炎小鼠模型,逐日测量休重.接种第3、6、9、11和14d分别取心脏,计算心脏指数,并取部分心肌组织进行HE染色分析病理学改变;病毒接种后的第3、第6和第9d,取部分组织匀浆进行转录组测序,分析三个时间点的共同差异表达基因,对其进行GO和KEGG信号通路的富集,并对其中12个基因进行了 qRT-PCR的验证.在CVB3感染后,小鼠体重下降至对照组的80％,心脏指数在第3d明显升高,随后逐渐下降.通过转录组分析找到100个共同差异基因,从中选出的12个基因,经qRT-PCR验证与转录组表达趋势一致.GO和KEGG信号通路富集发现,CVB3感染后,小鼠心肌组织出现病毒性心肌炎、NK细胞通路,T、B细胞激活及先天性免疫反应通路的改变.差异基因的蛋白与蛋白互作网络分析显示,先天性免疫中MHC-Ⅰ型分子蛋白基因H2-Q7、H2-Kl、H2-D1等,NK细胞毒作用通路中的Gzmb、Gzma,以及蛋白酶体信号通路基因Psmb8、 Psmb9﹑Psmb10和lfit3位于相互作用中心.CVB3感染C57BL/6小鼠心肌组织的转录组变化涉及病毒性心肌炎、NK细胞和T、B细胞激活及先天性免疫反应等通路.CVB3感染引起的急性病毒性心肌炎是多通路和多基因综合作用的结果.