三角褐指藻△5-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

△5-脂肪酸脱氢酶是合成花生四烯酸的关键酶.根据已报道的△5-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从三角褐指藻基因组DNA和总cDNA中扩增得到1520 bp和1410 bp的特异片段,序列分析结果显示,结构基因中含有一个大小为110 bp的内含子,这是国内外首次报道.将△5-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0中,在大肠杆菌中筛选到含有目的片段的重组质粒pYPTD5,用电击转化的方法将重组质粒pYPTD5转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在缺省培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YPTD5,在合适的培养条件下,添加外源底物双高γ-亚麻酸和诱导物半乳糖,培养并收集菌体.通过脂肪酸甲酯气相色谱分析,表明三角褐指藻△5-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效的表达,将双高γ-亚麻酸转化为花生四烯酸,其底物转化率达到了45.9%.     

三角褐指藻D5-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

D5-脂肪酸脱氢酶是合成花生四烯酸的关键酶。根据已报道的D 5-脂肪酸脱氢酶基因设计引物, 分别从三角褐指藻基因组DNA和总cDNA中扩增得到1520 bp和1410 bp的特异片段, 序列分析结果显示, 结构基因中含有一个大小为110 bp的内含子, 这是国内外首次报道。将D5-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0中, 在大肠杆菌中筛选到含有目的片段的重组质粒pYPTD5, 用电击转化的方法将重组质粒pYPTD5转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中, 在缺省培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YPTD5。在合适的培养条件下, 添加外源底物双高g-亚麻酸和诱导物半乳糖, 培养并收集菌体。通过脂肪酸甲酯气相色谱分析, 表明三角褐指藻D5-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效的表达, 将双高g-亚麻酸转化为花生四烯酸, 其底物转化率达到了45.9%。     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因高效表达载体构建与原核表达

花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一,其种子中富含油酸和亚油酸。△^12脂肪酸脱氢酶（FAD2）是亚油酸合成的关键酶,催化油酸（18：1）在△^12位上脱氢生成亚油酸（18：2）,但由于△^12脂肪酸脱氢酶本身的特性,目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究,尚需对其结构和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。本文利用从花生中克隆的△^12脂肪酸脱氢酶基因（GenBank接受号为AY1006）构建高效表达载体,把花生△^12脂肪酸脱氢酶基因全长序列插入到大肠杆菌高效表达载体pRSETB中,构建了pRSET／HO-A融合表达载体,并转化到大肠杆菌表达菌BL21（DE3）pLysS中,在IPTG诱导下,pRSET／HO-A融合表达载体在BL21（DE3）pLysS菌株中高效表达了△^12脂肪酸脱氢酶。利用Clon-Tech蛋白纯化Kit进一步分离了目的蛋白,同时加入外源性底物油酸在20℃温育6h后,进行脂肪酸甲酯化处理,通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,所编码的酶具有△^12脂肪酸脱氢酶的活性,能将外源性的底物油酸转化为亚油酸,转化率为11．8％。花生△^12脂肪酸脱氢酶基因的原核表达目前国内外还未见报导,本实验为其进一步的大量纯化和结构功能分析奠定了基础。     

花生Δ~(12)脂肪酸脱氢酶基因高效表达载体构建与原核表达(英文)

花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一,其种子中富含油酸和亚油酸。△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是亚油酸合成的关键酶,催化油酸(18:1)在△12位上脱氢生成亚油酸(18:2),但由于△12脂肪酸脱氢酶本身的特性,目前还没有有效的方法将其纯化并在蛋白水平作进一步的研究,尚需对其结构和功能之间以及表达调控进行更深入全面的研究。本文利用从花生中克隆的△12脂肪酸脱氢酶基因(GenBank接受号为AY1006)构建高效表达载体,把花生?12脂肪酸脱氢酶基因全长序列插入到大肠杆菌高效表达载体pRSETB中,构建了pRSET/HO-A融合表达载体,并转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)pLysS中,在IPTG诱导下,pRSET/HO-A融合表达载体在BL21(DE3)pLysS菌株中高效表达了?12脂肪酸脱氢酶。利用Clon-Tech蛋白纯化Kit进一步分离了目的蛋白,同时加入外源性底物油酸在20℃温育6h后,进行脂肪酸甲酯化处理,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,所编码的酶具有?12脂肪酸脱氢酶的活性,能将外源性的底物油酸转化为亚油酸,转化率为11.8%。花生△12脂肪酸脱氢酶基因的原核表达目前国内外还未见报导,本实验为其进一步的大量纯化和结构功能分析奠定了基础。     

大豆油酸脱氢酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

大豆油酸脱氢酶(FAD2-1B)基因是种子特异表达基因,利用PCR方法从大豆基因组DNA中分离FAD2-1B基因的启动子片段,命名为FP.PLACE在线启动子预测工具分析表明:序列中含有多种典型的种子特异性表达元件,如Skn-1 motif、AACACA、SEF4 motif、E-box、ACGT等.将克隆得到的FP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-FP.通过农杆菌介导法在大豆各组织中进行瞬时表达,GUS组织化学染色显示FP驱动GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,在种子中有较高的表达活性,推测FP启动子具有种子特异表达活性.     

卷枝毛霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

为获得产高γ 亚麻酸的酿酒酵母工程菌株,应用RT PCR技术,从卷枝毛霉中扩增出△6 脂肪酸脱氢酶 基因,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYES412,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScI中,在SC ura合成培养基中筛选到转化酵母,在合适 的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸 色谱分析,结果表明:γ 亚麻酸占总脂肪的50.07%。迄今为止,这是国内外△6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母表 达量最高的报道。     

卷枝毛霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

为获得产高γ—亚麻酸的酿酒酵母工程菌株,应用RT—PCR技术,从卷枝毛霉中扩增出△^6—脂肪酸脱氢酶基因,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2．0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES412,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScl中,在SC—ura合成培养基中筛选到转化酵母,在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸色谱分析,结果表明：γ—亚麻酸占总脂肪的50．07％。迄今为止,这是国内外△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母表达量最高的报道。     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

High-Oleic Peanut Oils Produced by HpRNA-Mediated Gene Silencing of Oleate Desaturase

The quality of peanut oil largely depends on the quantity of oleic (18:1) and linoleic acids (18:2). These two acids comprise more than 80% of the total fatty acids in peanuts. The oleate desaturase (FAD2) gene is important for maintaining high oleic acid content. A partial conservative sequence of the FAD2 gene from peanut was selected. The sense and antisense 260-bp fragments were amplified and subcloned into pFGC1008 binary expression vectors. A total of 21 transgenic plants were obtained via Agrobacterium-mediated transformation. The resulting down-regulation of the FAD2 gene resulted in a 70% increase in oleic acid content in the seeds of transformed plants compared with a 37.93% increase in untransformed plants. The results demonstrated that the target genes were likely suppressed by hpRNA interference, a pathway capable of achieving phenotypic changes. The silencing of FAD2 enabled the development of peanut oils having novel combinations of oleic acid content that can be used in high-value applications, making this approach a reliable technique for the genetic modification of seed quality and the potential for enhancement of other traits as well.     

Oenococcusoeni苹果酸-乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸-乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸-乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d;取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量,采用t检验进行差异显著性分析,结果表明mleA基因进行了功能性的表达,将L苹果酸转化成L乳酸,L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著,苹果酸的相对降低率平均为20.95%。在有选择压力条件下,重组质粒相对稳定,而在无选择压力条件下,传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。     

酒类酒球菌mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸通透酶具有协助苹果酸 乳酸发酵 (MLF)的重要功能。以酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)优良菌系Oenococcus Lee SD 2a的总DNA为模板 ,用PCR方法克隆到苹果酸通透酶基因mleP ,构建了重组质粒pBMmleP。序列分析表明克隆到的基因序列与已报道的序列同源性为 99%。为使目的基因在酿酒酵母中表达 ,以大肠杆菌 酿酒酵母穿梭质粒YEp35 2为载体 ,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件 ,构建了重组表达质粒YEpmleP ,并转化酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)YS5 8。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。获得的转化子在添加了L 苹果酸 (5g L)的培养基中培养 4d ;取培养液上清用HPLC检测 ,结果显示重组转化子YSP的培养液中L 苹果酸剩余含量均低于空载体转化子YS35 2 ,因此所得酵母重组转化子对苹果酸的转运能力有所提高     

拟康氏木霉eg1基因的克隆及在酿酒酵母中的分泌表达

从拟康氏木霉3.3002基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸.编码蛋白EGI的N端为22aa组成的信号肽,其后依次为催化结构域、连接肽和结合结构域.采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,并将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载...     

黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母基因组中的整合及其在整合子中的稳定表达

把黑曲霉糖化酶cDNA连同酵母α因子启动子及其分泌序列,通过转化整合到酿酒酵母染色体DNA上,获得了整合型的分解淀粉酵母转化子。Southern印迹分析证明了糖化酶cDNA对酵母染色体DNA的整入。整合型转化子在以可溶性淀粉为碳源的培养基中分泌糖化酶活力达2．5u／m1,在非选择性培养基中连续转移10次．糖化酶分泌活力稳定不变。     

Characterization of gamma-glutamylamidase-glutaminase activity in Saccharomyces cerevisiae

In a foregoing paper we have shown the presence in the yeast Saccharomyces cerevisiae of an enzyme catalyzing the hydrolysis of L-gamma-glutamyl-p-nitroanilide, but apparently distinct from gamma-glutamyltranspeptidase. The cellular level of this enzyme was not regulated by the nature of the nitrogen source supplied to the yeast cell. Purification was attempted, using ion exchange chromatography on DEAE Sephadex A 50, salt precipitations and successive chromatographies on DEAE Sephadex 6B and Sephadex G 100. The apparent molecular weight of the purified enzyme was 14,800 as determined by gel filtration. As shown by kinetic studies and thin layer chromatography, the enzyme preparation exhibited only hydrolytic activity against gamma-glutamylarylamide and L-glutamine with an optimal pH of about seven. Various gamma-glutamylaminoacids, amides, dipeptides and glutathione were inactive as substrates and no transferase activity was detected. The yeast gamma-glutamylarylamidase was activated by SH protective agents, dithiothreitol and reduced glutathione. Oxidized glutathione, ophtalmic acid and various gamma-glutamylaminoacids inhibited competitively the enzyme. The activity was also inhibited by L-gamma-glutamyl-o-(carboxy)phenylhydrazide and the couple serine-borate, both transition-state analogs of gamma-glutamyltranspeptidase. Diazooxonorleucine, reactive analog of glutamine, inactivated the enzyme. The physiological role of yeast gamma-glutamylarylamidase-glutaminase is still undefined but is most probably unrelated to the bulk assimilation of glutamine by yeast cells.     

β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达

应用表面表达技术对来自Trichodermareesei的β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达及后期性质进行了研究。实验结果表明酵母表面表达酶有活性,该酶的最佳诱导时间为24h,最适温度是70℃,而酶活的最适pH是5．5。使异源表面表达了Bgl1的酵母在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长,发酵结果表明纤维二糖被明显利用了,但在培养186h后,发酵液中仍残留一定量的纤维二糖。这种技术对纤维素发酵系统中纤维二糖酶活性低的现状有所帮助。     

乳酸克鲁维酵母Cu/Zn-SOD基因的克隆及在酿酒酵母中的表达研究

根据Genbank中乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的Cu/Zn-SOD基因序列设计引物,通过PCR扩增得到Cu/Zn-SOD基因。在PGK1启动子驱动下,将该基因与荧光报告基因GFP融合,分别构建重组质粒YEplac195-PSGA和YCplac33-PSGA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303α菌株。通过菌落PCR和荧光显微观察证实乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的Cu/Zn-SOD基因在W303α中成功表达。将获得的阳性转化子在添加20mmol/L百草枯的发酵培养基中进行发酵,SOD的比活力和总活力分别是不添加百草枯培养基中发酵菌体的6.7倍和4.7倍。通过热激胁迫处理进一步探讨Cu/Zn-SOD对宿主sod1Δ酿酒酵母菌株EG118耐受力的影响,结果显示抗热击能力的顺序为EG118(YEplac195-PSGA)EG118(YCplac33-PSGA)EG118。以上结果为发酵工业中防止菌体老化和增强菌体的发酵能力提供一定的理论指导,也为后续的Cu/Zn-SOD体外分子定向进化改造奠定必要的基础。