青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

高纯度α_1-抗胰蛋白酶的提取、抗血清的制备及其火箭免疫电泳测定

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)是肝细胞分泌的一种糖蛋白,是血浆蛋白电泳α_1球蛋白的主要成份。它能抑制多种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶等的活性。α_1-AT在血浆中含量较高,在组织中广泛存在,对维持机体正常生理功能,防止组织过度破坏起重要作用。本文报道经我们改良的高纯度α_1-AT提取方法、抗血清的制备及其火箭免疫电泳定量测量方法。一、材料与方法 1、α_1-AT、蛋白质测定方法α_1-AT按Eriksson法测定胰蛋白酶抑制容量(TIC)。结晶胰蛋白酶为Sigma产品,胰蛋白酶的特异性     

反胶束法萃取核桃胰蛋白酶抑制剂及其抗虫研究

植物胰蛋白酶抑制因子对植物本身具有保护作用,能调节植物蛋白质的合成和分解,并具有抗虫作用。为明确核桃蛋白酶抑制剂对小菜蛾的抗虫效果,该研究采用AOT/异辛烷反胶束法和亲和层析法萃取及纯化核桃胰蛋白酶抑制剂,命名为WTI,并对其抑制活性和生物活性进行测试。迪克森作图法测得纯化的核桃胰蛋白酶抑制剂的抑制常数为2.1×10-9mol/L。抗虫试验表明,小菜蛾自1龄起至化蛹前的整个幼虫阶段中,核桃胰蛋白酶抑制剂均对其产生了较强的毒杀作用。尤其是在1-3龄期,效果最佳。与对照组相比,WTI能延迟小菜蛾的化蛹时间,降低其化蛹率。核桃胰蛋白酶抑制剂对小菜蛾有明显的毒杀作用,但不表现出明显的生长抑制作用,且一定浓度的核桃胰蛋白酶抑制剂能将小菜蛾扼杀在其化蛹之前,从而能够控制其繁殖。     

非洲爪蟾血清白蛋白的分离纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过凝胶过滤层析及两步阴离子交换层析,从非洲爪蟾(Xenopus laevis)的血清中获得了其68kDa的血清白蛋白。与大蹼铃蟾血清白蛋白相似,非洲爪蟾血清白蛋白也具有抑制胰蛋白酶的活性,但其抑制活力相对较低,180nmol/L的非洲爪蟾血清白蛋白能抑制84%的胰蛋白酶活性(30nmol/L)。经表面等离子共振法获得了其与胰蛋白酶的结合动力学常数,解离平衡常数KD=1.44×10-6mol/L。经Western blot分析发现,非洲爪蟾的皮肤中也分布有血清白蛋白。推测两栖类动物血清白蛋白具有的胰蛋白酶抑制活性可能是其抵御天敌捕食的一种防御措施。     

木菠萝凝集素结合部位糖的特异性

用定量免疫沉淀法和定量免疫沉淀抑制法研究了从木菠萝(Arthrocarpus integrifolia)种子提取的凝集素(jacalin)结合部位糖的特异性。Jacalin最强烈地沉淀含有DGalβ1→3DGalNAc结构的无活性抗冻糖蛋白,不同程度非特异地沉淀各种血型物质。研究发现凝集素结合部位对DGalβ→3DGalNAc有最高特异性。最强抑制剂是DGalβ1→3DGalNAcal→φNO_2,其抑制活性分别比DGalNAc和DGal高380倍和1000倍。对于各种甲基化或对硝基酚化的糖苷以及寡糖,除methylaDGalNAc_f外,仅α-构型表现出抑制活性,所有β-构型的糖苷均无抑制活性,jacalin结合部位对糖的结合是构型依赖性的。     

高纯度α_1-抗胰蛋白酶的提取、抗血清的制备及其火箭免疫电泳测定

α_1-抗胰蛋白酶(a_1-AT)是肝细胞分泌的一种糖蛋白,是血浆蛋白电泳α_1球蛋白的主要成份。它能抑制多种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶等的活性。     

猪血浆α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-Antitrypsin,简称α_1-AT)是由肝细胞分泌的一种糖蛋白,是存在于动物血液中的一种重要的蛋白酶抑制剂,它能抑制多种丝氨酸类蛋白水解酶,占血浆胰蛋白酶抑制总活力的90％以上。α_1-AT通过调节蛋白水解酶的活性而参与机体的一系列生理活动,如血液凝固、纤维蛋白溶解、组织激肽释放、细胞融合、大分子装配和免疫反应等过程,对防止组织过度损伤有重要作用。目前国际上对人的α_1-AT研究较多,而对猪α_1-AT的研究甚少,仅见     

在高浓度1,4-丁二醇中酶促合成去B链C端六肽胰岛素

用含80％1,4-丁二醇的混合溶剂,以胰蛋白酶酶促,由去八肽胰岛素(DOI)合成了去六肽胰岛素(DHI),总产率为35％。1,4-丁二醇的溶解性能好,在浓度高达80—90％时不明显抑制酶活力,DOI的氨基无需保护,溶液中无高聚物或沉淀形成。     

固定化胰蛋白酶亲和层析法制备低STI残存大豆分离蛋白质

聚苯乙烯阴离子交换树脂(GM201)经预处理除去杂质后先与戊二醛(2—6％)反应,再与胰蛋白酶(5000u/mg,8—10mg/mL,pH 8.0)反应即制得固定化胰蛋白酶。此法得到的固定化胰蛋白酶具有良好的热稳定性,贮藏稳定性和操作稳定性,可用于工业化目的。脱脂豆粉经萃取(PH9.0)后,稀释4倍,在pH5.0下沉淀分离出大豆球蛋白,然后用酸性水(pH5.0)洗涤两次,并进行碱溶与酸沉淀两次,即可将大豆分离蛋白质的STI残留降低到1.85％,比活性降到1u/mg以下。最后再用固定化胰蛋白酶亲和层析,就可以除去大豆分离蛋白质中残留的STI。     

测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测

目的:制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法:取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果:自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95%,酶比活力为200 U/mgP(TAME)以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论:制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。     

波叶青牛胆胰蛋白酶抑制剂的纯化及其性质研究

采用亲和层析及电泳制备等方法 ,从防已科植物波叶青牛胆 (Tinosporacrispa)根茎中分离到一种胰蛋白酶抑制剂TCTI。对其性质研究表明 :TCTI的相对分子量约为 10 0kD ,对牛胰蛋白酶的抑制常数Ki为 2 0 8× 10 7mol/L (BAPNA为底物时 ) ,摩尔抑制比为 1∶3 5 ,是一种抑制活力很强的竞争性抑制剂。TCTI具有很高的耐热性 ,在 10 0℃加热 60min ,仍保持 93%的抑制活力。另外 ,TCTI在低温容易结晶     

胰蛋白酶的天然抑制剂

一、引言在自然界存在着一类能抑制胰蛋白酶的蛋白质。它们中固有些专一地抑制胰蛋白酶;有些除胰蛋白酶外,还能抑制其他生物活性物质,如胰凝乳蛋白酶、溶血纤维蛋白酶(plasmin)等;近年还发现一些所谓多头抑制剂(multiheaded inhibitor),它们能同时,并按一定比例地抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。胰蛋白酶抑制剂广泛地分布在动、植物中。这类蛋白质的生理作用,还不很清楚。在胰脏和胰液中的胰蛋白酶抑制剂据推想,此抑制剂可能使那些由胰蛋白酶原转变而来的胰蛋白酶在胰脏或其导管系统中失去活性,从而对于胰脏本身具有保护作用。显然,对它们的研究,将有助于对动、植物机体内某些     

日本血吸虫琥珀酸氧化酶的研究

应用測压法和分光光度法証明了日本血吸虫含有琥珀酸氧化酶,琥珀酸脫氫酶,琥珀酸-細胞色素c还原酶和細胞色素氧化酶等完整系統。血吸虫的琥珀酸氧化酶活力与細胞色素c浓度有关,浓度增加,酶活力上升,在0.4×10~(-5)—2×10~(-5)M之間与酶活力成直綫关系。酶活力与磷酸盐浓度亦有一定关系,浓度愈低,酶活力愈強。在酶作用的最适条件下(琥珀酸鈉,0.02M;細胞色素c,2×10~(-5)M;磷酸盐緩冲液,0.01M,pH7.4)測定合抱成虫匀浆的酶活力,結果为:氧耗量Qo_2=30.3微升/小时/毫克氮量;琥珀酸耗量Q_S=322微克/小时/毫克氮量;延胡索酸产生量Q_F=157微克/小时/毫克氮量。当雌雄虫分別測定时,在等氮量基础上,雌虫酶活力比雄虫高。丙二酸鈉,二乙基二硫代氨基甲酸鈉(銅試剂)和氰化物都能強烈地抑制琥珀酸氧化酶活力。治疗血吸虫病常用的几种銻剂在2×10~(-3)M时,体外試驗,对此酶活力无明显的抑制作用。此外,氰化物除抑制細胞色素氧化酶外,还能抑制琥珀酸脫氫酶(用甲烯蓝方法測定)。与細胞色素c相似,維生素K_3亦能刺激匀浆的呼吸。此外,我們发現了日本血吸虫匀浆經过加热处理后,可以分离出一种耐热的“还原物貭”,对細胞色素c有化学的还原作用。本文还討論了血吸虫琥珀酸的代謝途径和細胞色素系統在呼吸鏈中可能占有重要地位。     

从半夏中提取的胰蛋白酶抑制剂及其特征

应用硫酸铵分级、无离子水沉淀、2.5%TCA 处理、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析以及胰蛋白酶-琼脂糖凝胶亲和层析,从植物半夏新鲜块茎中分离纯化到一种胰蛋白酶抑制剂。半夏抑制剂只抑制胰蛋白酶对酰胺、酯、血红蛋白和酪蛋白的水解,不能抑制胰凝乳蛋白酶、舒缓激肽释放酶、枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶对各自底物的水解。抑制剂对猪胰蛋白酶水解酰胺、酯、血红蛋白和酪蛋白的重量抑制比值分别为1∶0.71、1∶0.88、1∶0.71和1∶0.71。从分子大小的范围看,半夏胰蛋白酶抑制剂应属大分子抑制剂。     

水稻黄化苗PAL内源性抑制物的初步纯化及其基本性质

从去胚乳水稻黄化苗中提取、并部分纯化了苯丙氨酸解氨酶的抑制因子(PAL-I)。它是非透析性的蛋白质;大部分活力可被蛋白酶(胰蛋白酶、链霉蛋白酶)所破坏。动力学实验表明PAL-I对PAL的抑制作用是竞争性的。水稻PAL-I不仅能抑制水稻PAL,而且能抑制从玉米、小麦、马铃薯块茎切片中提取的PAL;但不能抑制从水稻中提取的多酚氧化酶、α-淀粉酶(过氧化物酶除外)。     

丝瓜籽中一种具有翻译抑制活性和胰蛋白酶抑制剂活性的多肽——Luffin P1的纯化和性质

通过硫酸铵分级沉淀、CM 5 2阳离子交换层析、蓝胶亲和层析和FPLCMonoS阳离子交换层析 ,从丝瓜籽抽提液中分离到一种多肽luffinP1。经MALDI TOFMS测得其分子量为 5 2 2 6 .5。氨基酸序列测定及同源性分析发现 ,luffinP1的N端 11个氨基酸序列与丝瓜籽中的一种 6 .5K富含Arg Glu的多肽AGRP的部分序列相同 ,并与南瓜籽中一种胰蛋白酶抑制剂C2肽具有很高的同源性。体外分析表明 ,luffinP1同时具有两种生物活性 :(1)对兔网织红细胞裂解液系统蛋白质生物合成有较强的抑制作用 ,IC50 为 0 .6nmol L ;(2 )具有明显的胰蛋白酶抑制活性 ,IC50 为 2 2 μmol L。     

从半夏中提取的胰蛋白酶抑制剂及其特征

应用硫酸铵分级、无离子水沉淀、2.5%TCA处理、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析以及胰蛋白酶-琼脂糖凝胶亲和层析,从植物半夏新鲜块茎中分离纯化到一种胰蛋白酶抑制剂。半夏抑制剂只抑制胰蛋白酶对酰胺、酯、血红蛋白和酪蛋白的水解,不能抑制胰凝乳蛋白酶、舒缓激肽释放酶、枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶对各自底物的水解。抑制剂对猪胰蛋白酶水解酰胺、酯、血红蛋白和酪蛋白的重量抑制比值分别为1∶0.71、1∶0.88、1∶0.71和1∶0.71。从分子大小的范围看,半夏胰蛋白酶抑制剂应属大分子抑制剂。     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氨基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨肽酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生理和生长发育的影响

本研究根据棉铃虫Helicotverpa ormigera(Hubner)幼虫中肠蛋白酶在离体条件下对蛋白酶抑制剂的反应,选择具有较强抑制作用的大豆胰蛋白酶抑制剂,以0.21-4.2%(干重)的浓度配入幼虫人工饲料,测定了幼虫短期和长期取食这些饲料引起的中肠类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力的变化和生长抑制效应。短期取食抑制剂的幼虫,中肠弱碱性类胰蛋白酶活力显著增高,在4.2%。浓度下比对照高出21%;强碱性类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,生长发育受到明显抑制。长期取食低浓度(0.84%)抑制剂的幼虫,弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力显著增高,强碱性类胰蛋白酶活力显著降低。总蛋白酶活力变化不显著;长期取食高浓度(4.2%)抑制剂的幼虫,强碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,其它酶活力变化不显著。抑制剂随浓度的增高对幼虫生长的抑制作用加强,但浓度高于0.84%后,抑制强度的变化减小。据此作者认为,蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用,从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏,昆虫消化过程受阻,影响生长发育。     

慈菇蛋白酶抑制剂A和B的活性中心探讨

慈菇蛋白酶抑制A和B（APIA和APIB）是一种双头多功能抑制剂。它们的一级结构和cDNA序列已经被阐明。为了找到它们的活性中心,利用定点诱变的方法将APIB中根据与其他抑制剂家族的序列比较所推断的可能的活性中心残基;Lys^44,Arg^76和Arg87分别用Pro替代,所得到的突变基因分别在酵母分泌体系中得到了表达,与天然的APIB相比,K^44P-APIB对脂蛋白酶的抑制活力没有改变;而R^76P-APIB和R^87P-APIB对胰蛋白酶的抑制活力都分别下降了一半,由原料的抑制两分子变成了一分子,表明Arg^76和Arg^87分别是APIB的两个活性中心残基,而Lys^44则不是,为了证实以上结论,进一步制备了另外3种突变体（K^44P-R^76P-APIB,K^44P-R^87P-APIB,R^76P-R^87P-APIB)。在每个突变体中,3个可能的活性位点中只保留1个,有关的抑制活力测定表明,K^44P-R^76P-APIB(只保留Arg^87)和K^44P-R^87P-APIB(只保留Arg^76)分别只抑制一分子胰蛋白酶,而R^76P-R^87P-APIB(只保留Lys^44)对胰蛋白酶基本不抑制,从而肯定了以上结论,经过测定,两个突变体K^44P-R^87P-APIB对胰蛋白酶的抑制常数Ki分别是0.39nmol/L和0.47nmol/L。突变体R^87L-APIB(APIA中87位是Leu)丧失了接近一半的胰蛋白酶抑制活力,但同时对胰凝乳蛋白酶的抑制活性由原来的基本不抑制变成和APIA相同的可以抑制一分子,证明了Leu^87是APIA的抑制胰凝乳蛋白酶的活性中心位点。