某些物理化学因素对竹红菌甲素敏化的人红细胞膜乙酰胆碱酯酶的光失活作用的影响

本文以人红细胞膜乙酰胆碱酯酶力作用对象,研究了甲素浓度、pH、温度等因素对甲素致敏的酶光失活的影响,并计算了不同条件下的酶失活速率常数.甲素与某些光敏化剂相比,有以下特点:(1)甲素光敏化效率随着pH降低而增加,(2)光强指数α>1,(3)甲素在400nm—600nm波长范围内均有较大的光敏化作用.后性氧清除剂的试验结果表明,乙酰胆碱酯酶的光失活主要是单线态氧的作用,其它活性氧也有一定作用.     

竹红菌乙素敏化的人红细胞膜结构光损伤的Raman光谱特征

采用Raman光谱从分子水平揭示了竹红菌乙素光敏损伤的人红细胞膜发生膜蛋白交联和膜脂脂质过氧化导致其功能变化 ;膜流动性和离子通透性增加的本质是竹红菌乙素产生的活性氧 ( ¹O₂ ,O₂ ^-·和·OH等 )破坏了红细胞膜的有序结构 ,使膜蛋白主链结构的α 螺旋、β 折叠明显减少 ,无规卷曲增加并使其侧链结构的巯基基团、吲哚环、对羟苯基环、单基取代苯基环等也明显减少 .与此同时 ,随着光照时间的增加 ,膜脂的反式构象呈先增加后减少的趋势 ,它的扭曲构象则正好相反 .膜蛋白和膜脂构象不灵敏的CH₂ 和CH₃弯曲振动谱线的明显下降 ,揭示它们有链的断裂 .     

竹红菌甲素引起红细胞膜蛋白的光敏交联

为了探讨竹红菌甲素对红细胞膜蛋白的光敏交联机理,我们使用了一些专一性及非专一性的基团修饰剂来修饰膜蛋白,试图说明膜蛋白的光敏交联究竟是由膜蛋白的巯基光氧化所引起的,还是膜蛋白的氨基酸与其侧链氨基之间的交联所引起的。我们分别采用N-乙基顺丁烯二酰抱亚胺(NEM)修饰膜蛋白的巯基,用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)来修饰色氨酸残基,用乙氧甲酸酐(DEP)修饰组氨酸残基,及用琥珀酸酐(SA)修饰氨基。测定了红细胞膜修饰前后及有竹红菌甲素存在时,光照前后的膜蛋白巯基及膜氨基的变化,膜蛋白内源性荧光的变化,以及对膜蛋白形成交联的影响。结果表明:NEM、DEP和NBS修饰的膜, 在有甲素存在时,光照对巯基影响很小,而对SA修饰的膜有明显的光敏作用。甲素对膜蛋白氨基的影响小于巯基,仅降低含量20%。甲素光照能引起NEM和SA修饰的膜内源荧光下降。甲素对NEM处理的膜仍能引起交联,但SA处理过的膜能抗交联,说明氨基在膜蛋白光敏交联中起着重要的作用。     

竹红菌甲素敏化嘌呤和嘧啶碱的光氧化作用及其影响因素

本工作利用光吸收和高效液相色谱(HPLC)技术研究了甲素对DNA分子中四种碱基A、G、C和T光氧化的敏化作用,发现在反应体系的pH为9.0、甲素浓度为3×10~(-5)mol/L、光照40分钟时,G和T紫外吸收明显降低;HPLC分析发现甲素敏化的G光氧化体系比对照体系多出现一组分峰(滞留时间0.927分钟),该峰用475nm波长检测比260nm波长检测灵敏。根据反应机制推测是G环破裂产物。在反应条件固定时,甲素敏化G的光氧化作用受pH、光照时间及甲素浓度影响极大。单线态氧淬灭剂——叠氮钠浓度在40—110mmol/L可部分抑制甲素敏化G的光氧化作用,>110mmol/L时反应完全被阻断,提示甲素对G光氧化的敏化作用主要通过单线态氧(~1O_2)即Ⅱ型机制起作用。本文还讨论了G光氧化的可能途径。     

用稳态荧光探针研究竹红菌乙素光敏损伤对人红细胞膜流动性的影响

本文以红细胞膜为材料,用了三种稳态荧光探针研究了HB光敏作用引起人红细胞膜流动性的改变.实验结果表明在HB光敏作用下,膜的旋转扩散速度和侧向扩散速度均发生明显变化,ANS和DPH探针测得HB引起膜流动性降低,也就是膜粘度增加,用芘探针结果则表明膜的侧向扩散变慢.本文还对HB光敏作用的机理进行了探讨,我们观察了数种单重态氧猝灭剂,羟自山基猝灭剂和抗氧化剂对于光敏作用的影响,分别测定了膜流动性和膜的内源荧光的变化,发现在HB光敏作用中,除了~1O_2的作用之外,还存在其它自由基的作用.在HB与HA光敏能力的比较中发现,在比较高一些浓度条件下,存在着HB大于HA的趋向.     

用稳态荧光探针研究竹红菌乙素光敏损伤对人红细胞膜流动性的影响

本文以红细胞膜为材料,用了三种稳态荧光探针研究了HB光敏作用引起人红细胞膜流动性的改变.实验结果表明在HB光敏作用下,膜的旋转扩散速度和侧向扩散速度均发生明显变化,ANS和DPH探针测得HB引起膜流动性降低,也就是膜粘度增加,用芘探针结果则表明膜的侧向扩散变慢.本文还对HB光敏作用的机理进行了探讨,我们观察了数种单重态氧猝灭剂,羟自山基猝灭剂和抗氧化剂对于光敏作用的影响,分别测定了膜流动性和膜的内源荧光的变化,发现在HB光敏作用中,除了~1O_2的作用之外,还存在其它自由基的作用.在HB与HA光敏能力的比较中发现,在比较高一些浓度条件下,存在着HB大于HA的趋向.     

人脑及红细胞膜乙酰胆碱酯酶的芳基酰胺酶活性

采用联合亲和层析法从人小脑及红细胞膜中纯化了ＡＣｈＥ,纯化的人脑及红细胞ＡＣｈＥ在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上呈一主带,分子量约为６６０００。人脑ＡＣｈＥ制备酯酶与酰胺酶比活性分别为１２９９与１４３Ｕ／ｍｇ,人红细胞ＡＣｈＥ制备分别为４５８４与７４７Ｕ／ｍｇ。人脑及红细胞ＡＣｈＥ制备的酯酶与酰胺酶活性最适ｐＨ较接近,在ｐＨ７．５－８．０之间,酯酶活性底物ＡＴＣｈ对其芳基酰胺酶活性有抑制作用。ＩＣ_（５０）分别为１０．２×１０~（－３）及３×１０~（－３）ｍｏｌ／Ｌ。梭曼对其酯酶及酰胺酶活性均有明显抑制作用,说明二者均需活性中心丝氨酸参与。     

人脑及红细胞膜乙酰胆碱酯酶的芳基酰胺酶活性

采用联合亲和层析法从人小脑及红细胞膜中纯化了ＡＣｈＥ,纯化的人脑及红细胞ＡＣｈＥ在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上呈一主带,分子量约为６６０００。人脑ＡＣｈＥ制备酯酶与酰胺酶比活性分别为１２９９与１４３Ｕ／ｍｇ,人红细胞ＡＣｈＥ制备分别为４５８４与７４７？ｍｇ。人脑及红细胞ＡＣｈＥ制备的酯酶与酰胺酶活性最适ｐＨ较接近,在ｐＨ７．５＝８．０之间,酯酶活性底有抑制作用。ＩＣ５０１０．２×１０＾－３及３×１０＾－３ｍ     

竹红菌甲素对红细胞膜内脂双层的微扰

In this paper, using human erythrocyte membrane, the effect of Hypocrellin A on the lipid bilayer of the membrane was studied by measuring the change of the fluidity of the membrane, the energy transfer of the fluorescent probes, the shift of the fluorescent emission peaks, and the split of band-a of Hypocrellin A. The results showed that in the presence of HA, the fluidity of erythrocyte membrane was increased, the fluorescence intensity of the probes was decreased, and the fluorescence peaks shifted blue. These phenomena took place more seriously with the increment of HA concentration. Meanwhile, the band-a of HA excitation spectra was splitted. It was suggested from all of the results that HA could significantly perturb the lipid bilayer of erythrocyte membrane, there were interactions existing between the Hypocrellin A and the membrane. The HA was mainly located in the middle range of the membrane lipid bilayer when in high concentration (mainly to the 12-16 positions of the long chain fatty acid).     

竹红菌甲素对红细胞膜内脂双层的微扰

本文以荧光探针为手段,以人红细胞膜为材料,测量了膜偏振度的改变,荧光探针能量转移,荧光峰的蓝移和甲素激发峰的分裂。结果表明在有竹红菌甲素存在时,红细胞膜偏振度增加,探针荧光强度减小,荧光峰蓝移。甲素浓度增加时,上述现象更加明显,即它们之间有正的相关关系。同时,甲素激发光谱的a带发生分裂。据此,我们认为甲素对红细胞膜内脂双层产生明显微扰,甲素与红细胞膜间存在着相互作用。在甲素浓度较大时,它主要是渗入到红细胞膜脂双层的深层部位(膜脂肪酸链的12—16位)。     

竹红菌甲素对红细胞膜光敏作用机理的研究

本文研究了甲素对红细胞膜的光敏化作用,证实了此光敏作用是需要氧分子参加的。还使用单重态氧~1O_2猝灭剂NaN_3和DABCO,以及O_2~-超氧阴离子自由基猝灭剂SOD酶,来研究甲素对红细胞膜蛋白和膜类脂光氧化过程的反应机理。结果表明,NaN_3、DABCO和SOD酶分别对膜蛋白SH基和膜类脂的光氧化没有明显的影响,仅NaN_3对膜蛋白光敏交联有部分抑制作用。而这些光敏作用在D_2O中也未见明显加剧。说明甲素对红细胞膜的光氧化机理可能涉及~1O_2或O_2~-,但也有其他的“活泼态氧”在起作用。     

竹红菌甲素对红细胞膜上几种酶光敏失活作用的研究

Hypocrellin A (HA)-sensitized photoinactivation of enzymes in human erythrocyte membrane, including AchE, GPDH, Na(+)-K+ ATPase, Ca2(+)-Mg2+ ATPase were studied in this paper. The sensitivity of these four enzymes inactivated by HA and light are as following order: Ca2(+)-Mg2+ ATPase greater than Na(+)-K+ ATPase greater than GPDH greater than AchE. The relationship among ATPase inactivation, sulfhydryl photoinactivation and lipid peroxidation was also investigated. Results show that SH group photooxidation probably is one of the major reasons of enzyme inactivation whereas lipid peroxidation has little effect. The isolated GPDH was less sensitive than that membrane-bound, GSH, NAD acted protectively on GPDH and ATPase respectively. The evidence of electrophoresis and protein intrinsic fluorescence showed that protein structure did not change significantly even though most activity had lost in case of GPDH.     

竹红菌甲素对红细胞膜上几种酶光敏失活作用的研究

本文比较了竹红菌甲素对人红细胞膜AchE,GPDH,Na~ -K~ ATPase和Ca~(2 )-Mg~(2 )ATPase的光敏失活能力,结果表明甲素对Ca~(2 )-Mg~(2 )ATPase作用最强,Na~ -K~ ATPase次之,GPDH再次之,AchE最不敏感,甲素还引起膜蛋白巯基氧化,膜脂质过氧化。其中,巯基氧化可能是ATPase光敏失活的主要原因,而脂质过氧化对ATPase活力损伤作用不大。游离GPDH不如与膜结合的GPDH敏感。GSH,NAD分别对ATPase,GPDH有保护作用。膜蛋白的电泳及内源荧光证据表明:在GPDH活力受到严重损伤时,酶结构并未发生剧烈改变。     

类脂过氧化对竹红菌甲素引起膜蛋白光敏交联的影响

本文研究了丙二醛与红细胞膜温育后所形成的交联。当丙二醛浓度在5×10~-4mol/L以上时,膜蛋白发生交联,并且在460nm处有荧光特征峰出现。而甲素光敏所致膜蛋白的交联,在460nm处没有荧光峰,光敏所产生的内源丙二醛量很少,不足以引起红细胞膜反应形成交联。我们还研究了BHT和Vit E两种抗氧化剂对甲素光敏作用的影响。BHT能抑制类脂过氧化,不能抑制膜蛋白巯基的变化和膜蛋白的交联。而Vit E仅不能抑制膜蛋白的交联。以上结果均说明甲素光敏所致膜类脂过氧化是不参与膜蛋白交联的。     

竹红菌甲素对(CHO)细胞的光动力敏化致死效应的研究

我们首次观察分析了竹红菌甲素对CHO细胞的可见光(碘(钅马)灯:全光、320-460nm、350-490nm)动力敏化致死作用,并与紫外线照射的作用作了比较.竹红菌甲素光动力敏化作用所造成的细胞亚致死和潜在致死损伤较不易被修复(或累积效应较不明显).我们认为该药物的光敏作用的“靶”主要是细胞膜.     

竹红菌甲素对红细胞膜的光损伤

光敏化剂竹红菌甲素在可见光区有三个吸收峰,其波长为475nm、545nm和585nm。在有竹红菌甲素存在时,红细胞膜样品用250W碘钨灯照射,其光强度为48尔格/平方毫米·秒。辐照后观察到以下一些效应:1)膜蛋白SH基含量减少。2)膜蛋白敏感的氨基酸残基,如组氨酸、半胱氨酸和色氨酸含量降低。3)膜蛋白发生光??聚集作用。4)多聚不饱和类脂发生过氧化作用。竹红菌甲素光照不同时间后和竹红菌甲素光照后放置一段时间,再加到红细胞膜中,均能观察到膜蛋白SH基含量降低。提示竹红菌甲素的光氧化产物是稳定的,能引起红细胞膜的光损伤。     

甲基毒死蜱对红细胞膜乙酰胆碱酯酶的抑制作用及其与膜脂相互关系

以人红细胞膜为材料,研究了甲基毒死蜱与膜上乙酰胆碱酯酶(AChE)的相互作用及其与膜脂的关系。结果显示,甲基毒死蜱对人红细胞膜AChE有明显的抑制作用,与膜温育30min,其半数抑制浓度约为0.10 mmol/L。动力学分析表明,其抑制作用为非竞争性。0.2％Triton X-100并不改变AChE对甲基毒死蜱的敏感性,亦即AChE上甲基毒死蜱的作用部位与其所处的脂质微环境无关。     

竹红菌甲素敏化DNA的光氧化——甲素与DNA的结合及DNA某些理化性质变化

本文研究了光敏氧化前后甲素与DNA的结合以及这种结合对DNA-EB复合物荧光强度、DNA融解温度和圆二色谱的影响。利用Sephadex G-150凝胶过滤和同位素技术分离甲素-DNA复合物,测得光照前后甲素与DNA的结合率分别为15.2％和27.8％。荧光测定和琼脂糖凝胶电泳结果显示:甲素可阻碍DNA-EB复合物的形成、使DNA-EB复合物的荧光强度减弱,光照甲素对DNA-EB复合物的荧光淬灭作用较未光照者为强。甲素敏化DNA光氧化后的荧光淬灭、DNA融解温度降低和CD谱变化提示:甲素敏化DNA光氧化涉及碱基破坏及DNA双螺旋结构改变。