放射诱导调控腺病毒介导gfp报告基因在肿瘤细胞内的表达

为建立放射诱导基因表达调控系统并用于肿瘤的基因治疗,利用PCR技术克隆出放射诱导基因Egr-1基因启动子,经测序证实后与报告基因gfp连接,并利用新型、高效的细菌内同源重组腺病毒载体制备方法制备出重组腺病毒AdEgr-GFP。感染腺病毒的肿瘤细胞给予不同剂量的γ射线照射,体外采用FACS方法检测GFP的表达发现,照射可明显提高GFP表达,并呈剂量依赖性,Western印迹检测也显示类似的结果,为进行体内实验,瘤内注射AdEgr-GFP腺病毒后48h,肿瘤局部接受不同剂量的γ射线照射,8h后制备肿瘤组织标本用于分析GFP的表达。肿组织图像分析结果显示,γ射线照射可显著提高肿瘤组织中GFP的表达,并呈剂量依赖性,结果说明,放射经Egr-1启动子可有效调控腺病毒介导gfp基因的肿瘤细胞内表达。     

重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体鸡尾酒暴露后预防效果评价

本研究对重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体鸡尾酒暴露后预防效果进行评价,选用狂犬病毒国内代表性疫苗株、实验室固定毒株及街毒株共11株病毒,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)分析针对狂犬病毒糖蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号表位的三株单抗CR57(I)、RV08(II)和RV3A5(Ⅲ)及其鸡尾酒配伍的中和谱,在此基础上选用狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11感染仓鼠腓肠肌,进一步研究重组人源抗狂犬病毒单抗及其鸡尾酒制剂暴露后保护效果,结果显示CR57、RV08、RV3A5及其三联配伍制剂对11株狂犬病毒均具有明确的中和作用,按中和效价1∶1∶1配伍组成的鸡尾酒组合制剂对这些毒株的中和能力没有减弱,表明三株抗体间无相互干扰,对个别毒株(JX08-45、Flury、SRV9)的中和活性表现出协同作用;三株单抗CR57、RV08和RV3A5单独应用或是三联配伍应用的暴露后保护率达100%,与HRIG单独免疫相比较具有更优秀的动物保护活性;在与疫苗联合应用方面重组人源单抗与HRIG在暴露后预防的效果相仿,均可达到100%的保护率,所以重组人源单抗具有替代HRIG应用于狂犬病暴露后预防与保护的潜力,为我国具有自主知识产权的狂犬单抗鸡尾酒制剂的研发打下基础。     

纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)固体发酵生产γ-PGA

γ-多聚谷氨酸是一种生物可降解的高分子材料 ,可应用于许多领域 ,因此受到普遍的重视。目前γ-PGA液体发酵水平为 5 0～ 60g/ L。报告了用大豆固体发酵生产γ-PGA的方法 ,其中包括 :菌种的筛选 ,发酵和提纯方法 ,高压液相法测定含量和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果 :BacillussubtilisnattoHW_1发酵活性为 1 1 5g/ kg大豆。γ_PGA的纯度为 95 %以上 ,分子质量为31 6kDa。另外可在大豆固体发酵生产纳豆激酶的同时生产回收γ-PGA ,既可以降低产品成本 ,又可以开发应用γ-PGA。     

菠萝蜜低聚肽对γ射线辐照小鼠氧化损伤的保护作用

目的：探究菠萝蜜低聚肽（JOPs）对γ射线辐照导致小鼠氧化损伤的保护作用。方法：选取96只SPF级雌性BALB/c小鼠,按体重随机分为空白组、模型组、乳清蛋白组（0.40 g/kg·BW）及3个JOPs干预组（0.20、0.40、0.80 g/kg·BW）,每组随机分为2个亚组,8只/亚组。行灌胃干预第14 d除空白组外,小鼠接受60Co γ射线全身辐照,剂量3.5 Gy,剂量率1 Gy/min。两亚组分别在辐射后第3 d和第14 d检测小鼠血清和肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）活性及丙二醛（MDA）水平。结果：辐照后第3 d及第14 d,相比空白组,模型组血清、肝脏SOD及GSH Px活性均显著降低,MDA水平均显著增高,JOPs各剂量组小鼠血清及肝脏MDA水平均显著低于模型组与乳清蛋白组;辐照后第3 d,相比模型组,JOPs各剂量组小鼠血清及肝脏SOD、GSH Px活性均显著增高,且高剂量组小鼠血清SOD活性及血清、肝脏GSH Px活性与中、高剂量组肝脏SOD活性均显著高于乳清蛋白组;辐照后第14 d,相比模型组,JOPs各剂量组小鼠血清及肝脏SOD、GSH Px活性均显著增高,且JOPs各剂量组小鼠血清SOD活性与高剂量组肝脏SOD、GSH Px活性均显著高于乳清蛋白组。结论： JOPs对γ射线辐照所致氧化损伤具有保护作用。     

西妥昔单抗注射液生物学活性分析

目的:对自行开发的爱必妥类似物西妥昔单抗进行体内及体外活性分析。方法:采用表皮生长因子受体(EGFR)结合实验、表面等离子共振法(SPR)、磷酸化抑制实验及细胞生长抑制实验分析西妥昔单抗的生物学活性,通过小鼠异体移植肿瘤的抑制实验分析体外生物学活性与药效关系。结果:体外亲和力分析结果表明,西妥昔单抗可特异结合人EGFR,亲和力与爱必妥相当(P0.05)。西妥昔单抗可抑制由表皮生长因子(EGF)引发的EGFR自体磷酸化,基于对EGFR磷酸化抑制而建立的西妥昔单抗生物学活性方法与西妥昔单抗的肿瘤细胞生长抑制作用进行了比较,结果显示西妥昔单抗抑制EGFR磷酸化的活性数值与其抑制细胞生长的活性一致。在鼠异体移植模型中,西妥昔单抗对A431细胞的肿瘤生长产生强烈抑制作用,对HT-29细胞的肿瘤生长也有剂量依赖性抑制。结论:采用的检测方法可用于西妥昔单抗的生物学活性分析,其体内与体外生物学效应与市售爱必妥没有差异。     

双氢青蒿素对Raji细胞放射敏感性的影响

目的：研究双氢青蒿素（DHA）对Raji细胞放射敏感性的影响并探讨其作用机制。方法：CCK8测定DHA对Raji细胞活力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡、胞内ROS及线粒体膜电位,Western blot检测AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达量。结果：实验分为对照组、DHA组（5 μmol/L DHA）、放射组（4 Gy γ射线）、联合放射组（5 μmol/L DHA和4 Gy γ射线）,与其他3组相比,联合放射组Raji细胞的线粒体膜电位显著降低（P<0.01）,胞内ROS含量和凋亡率显著升高（P<0.01）;此外,Raji细胞AKT表达量与其他3组相比无明显差异,但AKT的磷酸化受到抑制;Bcl-2表达量显著降低,而Bax、Cleaved-Caspase-3表达量显著升高。结论：DHA可能通过抑制磷酸肌醇3-激酶（PI3K-AKT）信号通路及激活了Raji细胞的线粒体凋亡途径,引起氧化应激反应,从而增加Raji细胞对放射的敏感性。     

贝伐珠单抗在肿瘤治疗中的应用研究进展

贝伐珠单抗是一种重组人源化免疫球蛋白 G1 单克隆抗体,可通过抑制血管内皮生长因子活性及抗血管生成,达到抑制肿瘤生长 的目的,目前已广泛用于结直肠癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的治疗,尤其是通过与基础化疗结合,能显著提高治疗的有效率以及延长 肿瘤患者的无进展生存期和总生存期。综述贝伐珠单抗的抗肿瘤作用机制、在不同肿瘤治疗中的应用、用于肿瘤治疗时机与疗效差异以 及不良反应和防治。     

γ-聚谷氨酸与D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物的制备及其生物活性

介绍了制备一种γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物［poly (γ-glutamic acid)-D-galactose esterifiable derivative-cisplatin complex compound,γ-D+-DDP］,并考察其抗肿瘤活性。主要通过生物发酵获得大分子γ-聚谷氨酸［poly (γ-glutamic acid) ,γ-PGA］,利用酸降解得到可以作为药物载体的小分子γ-聚谷氨酸;利用凝胶色谱柱检验小分子γ-聚谷氨酸的分子量;利用MTT法检测该复合物的体外抗肿瘤作用。结果表明：成功获得γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物,该复合物载药率达9.4% ~10.2%;该复合物对人肝癌细胞BEL-7402具有显著的杀伤作用,能引起细胞凋亡(HE染色观察得到)。因此,γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物是一种有效的抗肿瘤药物,具有潜在的临床应用价值;生物发酵的γ-聚谷氨酸可用于药物载体,赋予药物新的特点。     

热量限制通过HNF3γ下调NOX4表达来抑制内皮细胞的衰老

为了观察热量限制对主动脉内皮细胞中HNF3γ及NOX4基因表达的影响, 揭示HNF3γ-NOX4-活性氧通路介导热量限制抗内皮细胞衰老的分子机制, 文章将主动脉内皮细胞分为5组：对照组、高热量组、低热量组、siRNA+低热量组、siRNA+高热量组。应用逆转录实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)、Western blotting分析各组HNF3γ、NOX4 mRNA及蛋白水平变化, 并检测各组细胞内活性氧产量及细胞衰老程度变化。采用染色质免疫共沉淀分析HNF3γ蛋白与NOX4基因启动子区域结合情况, 萤光素酶报告基因检测HNF3γ蛋白结合后对NOX4基因启动子活性的影响。结果显示：与对照组比较, 低热量组HNF3γ mRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著升高(P<0.05), NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著降低(P<0.05); 高热量组HNF3γ mRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著降低(P<0.05), NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著升高(P<0.05); siRNA+低热量组及siRNA+高热量组中NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧水平及细胞衰老程度显著升高(P< 0.05)。染色质免疫共沉淀证实HNF3γ蛋白可与NOX4基因启动区域4个结合位点(-6 bp、-76 bp、-249 bp、-954 bp)结合。萤光素酶报告基因检测显示HNF3γ蛋白与NOX4启动子区域1个位点(-6 bp)、2个位点(-6、-76 bp)、3个位点(-6、-76、-249 bp)、4个位点(-6、-76、-249、-954 bp)结合, 可使NOX4启动子活性分别降低至对照组的80.15±4.64%、40.02.±2.15%、16.46±2.24%、12.13±1.46%, P<0.05。上述结果提示热量限制可上调HNF3γ基因表达, 增强HNF3γ蛋白活性, 促进HNF3γ蛋白同NOX4基因启动子区域结合, 抑制NOX4基因表达, 进而减少细胞内活性氧产生而延缓动脉内皮细胞衰老。     

呼吸道合胞病毒被动免疫制剂研究进展

呼吸道合胞病毒(RSV)是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染的主要原因之一,目前尚未研制出有效的疫苗,也没有特异性的治疗方法。被动免疫制剂能够有效预防RSV感染。静注RSV免疫球蛋白(RSV-IVIG)降低RSV易感儿童住院率,但其应用存在一定的局限性;抗RSVF蛋白的单抗Palivizumab是美国FDA批准的第一种用于传染病的人源化单克隆抗体,能够有效预防RSV感染、安全性高;其优化后的单抗Motavizumab亲和力和效力更强于Palivizumab。本文对RSV被动免疫制剂的研究进行了综述。     

HER2 阳性乳腺癌转移患者最佳治疗方案的研究进展

针对人表皮生长因子受体HER2 的靶向制剂曲妥珠单抗,显著改善了HER2 阳性乳腺癌转移患者疾病的发展状况,提高了 患者的总体生存期（OS）,然而耐药现象时有发生。其它靶向制剂如帕妥珠单抗,酪氨酸激酶受体抑制剂拉帕替尼和ado-transtusumab emtansine等克服了其耐药性,为治疗提供了更多选择。这些HER2 靶向制剂单用或联用已显示出良好的临床功效,但最 佳治疗次序依然未知。随着新型靶向制剂的出现,最佳治疗方案的研究成为热点。本篇综述重点阐述了目前HER2 阳性乳腺癌转 移患者最佳治疗方案的研究进展,以及新型靶向制剂的现有状况。     

高良姜素通过PTEN/AKT信号通路抑制乳腺癌发展并增加曲妥珠单抗抗肿瘤活性

本文旨在研究中药高良姜素对人乳腺癌的治疗作用,对乳腺癌治疗靶向药物曲妥珠单抗抗癌活性影响及其机制。通过建立乳腺癌肿瘤移植模型,研究高良姜素、曲妥珠单抗以及联合用药后的乳腺癌肿瘤进展,试验结束后获取组织进行免疫化学和免疫荧光分析,并进一步检测不同药物处理对细胞侵袭和转移能力的影响,通过TUNNEL法进行细胞凋亡分析,通过流式细胞术测定细胞周期,使用蛋白质印迹测定PTEN和AKT途径相关蛋白的表达,使用定量PCR测定PTEN以及AKT途径mRNA水平。结果显示,与对照组相比,高良姜素处理可以促进乳腺癌细胞中PTEN表达进而降低蛋白激酶B水平,抑制凋亡相关蛋白MDM和p53的激活,并增加Caspase-3的表达,最终抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡,而体内实验显示,高良姜素可以抑制裸鼠体内的肿瘤生长,并促进曲妥珠单抗的体内抗肿瘤活性。上述结果表明,高良姜素通过调控PTEN/AKT抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制乳腺癌肿瘤进展,同时增加曲妥珠单抗抗癌活性。     

人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

猪戊型肝炎病毒重组蛋白ORF2-V1单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的猪戊型肝炎病毒DQ株重组蛋白ORF2-V1免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接ELISA 筛选,获得了αC11,αC12,γH1,γF8,BC4和CH8 6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA 测定,单抗效价为: 细胞培养上清1∶1.60×103～1∶3.20×103,腹水为1∶1.28×106～1∶2.56×106; 经ELISA法测定,6株单克隆抗体均与重组蛋白ORF2-V1反应, 而不与ORF2其它部分片段的蛋白反应; 将试验中制备的MAbs分别用HEV swDQ株感染的A549细胞涂片进行IFA检测,同时分别用猪的阳性、阴性血清和SP2/0细胞上清做对照,制备的6株MAbs对感染细胞均呈现阳性反应,说明其可以与天然的病毒发生反应,并且与阳性多克隆血清比较,以单克隆抗体为一抗,IFA反应表现出良好的特异性。单抗的亚类鉴定结果表明,所有MAbs均为IgG1型,而且所有单克隆抗体的轻链均为κ链。单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,6株单抗分别针对4个不同抗原位点,McAb-γH1,BC4,CH8识别的位点各不相同,其中McAb-γH1,BC4识别的位点有部分重叠,McAb αC11,αC12,γF8识别同一位点,位于γH1,BC4识别位点的重叠区内。     

小鼠TAp63γ及两种突变体的原核表达、纯化和DNA结合活性

采用PCR扩增法得到小鼠TAp63γ野生型及两种缺失突变体的cDNA,3种cDNA与表达载体pGEX-2TK重组构建成GST融合表达质粒并转化感受态E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导了小鼠TAp63γ野生型及两种缺失突变体的可溶性表达. 诱导表达的菌液经离心收集菌体、超声破碎及Triton X-100增溶后获得可溶性表达蛋白粗提液. 利用Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出电泳均一的3种GST融合蛋白. 凝胶滞留分析证实仅野生型小鼠TAp63γ蛋白能特异结合p53靶序列,经序列比对及同源建模分析,表明小鼠TAp63γ DBD结合区的完整性、关键氨基酸的保守性及三维结构的相似性可能是其DNA结合活性所必需的.     

放射治疗中的一楔多用

自上世纪末物理学工作者发现了放射现象以后,这种性质即被应用于医疗领域。几十年来,放射医学不断地发展,并且逐步趋于正规化、合理化和最优化,在人类努力攻克癌症的今天,肿瘤的放射治疗日益显示出其巨大的潜力,放射治疗设备也由过去的镭锭、X光机发展到今天的钴—60治疗机、高能量电子直线加速器和后装治疗机。设备的不断改进和更新,使放疗不仅能治疗浅表肿瘤,而且使深部肿瘤的治疗也成为可能。同时,医院的放射物理工作者和临床医师也越来越关心射线在人体内的分布情况,有时,     

基于拉曼光谱的鼻咽癌细胞株总蛋白放射敏感性研究

本文以鼻咽癌细胞株CNE2为放射敏感性的研究对象,经不同剂量X射线照射及不同时间培养后分别提取总蛋白,用共聚焦显微拉曼光谱仪检测其拉曼光谱。统计分析表明:被测样品的拉曼光谱中观察到一些可以归属于蛋白质物质的较为明显的基团频率振动峰;不同剂量的X射线照射后,总蛋白质的平均拉曼光谱与对照组谱形基本一致,但与对照组间的光谱存在着对应峰信号强度的不同。实验提示:照射后谱峰强度的增大或减小,提示着相关物质含量有所改变。分析照射后癌细胞总蛋白拉曼光谱的变化情况,结合数学统计方法,以探寻放射敏感性的特征拉曼标志,可以作为研究肿瘤放射敏感性的手段之一。     

抗t-PA单克隆抗体的制备及初步应用

用猪心t-PA和人黑色素瘤细胞分泌的t-PA作抗原,经腹腔及脾内免疫Bal b/c小鼠。用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,细胞融合串达85％,获得4株抗t-PA杂交瘤细胞株,鼠腹水抗体效价达1∶10~5;Western Blot结果表明该单抗所结合的抗原分子量与t-PA相符,证明所获得的单抗为特异的抗t-PA单抗;对t-PA的纤溶活性中和抑制试验结果表明,4株单抗中的1株能完全抑制st-PA的纤溶活性,另外3株表现出程度不等的抑制;其中1株亚类为IgG,另外3株为IgM。杂交瘤细胞株无支原体污染;染色体数目正常。对该抗体进行初步纯化后,将其应用于rt-PA的研究中。     

以Ⅳ型胶原酶为靶点的小型化单抗免疫偶联物的抗肿瘤作用

Ⅳ型胶原酶与肿瘤的侵袭、转移以及新血管生成等过程密切相关. 以Ⅳ型胶原酶为分子靶点, 利用小鼠抗Ⅳ型胶原酶单抗构建了小型化的Fab'片段与高效抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)的免疫偶联物 (Fab'-LDM). 偶联物的分子量约为65 kD, 偶联分子比为1︰1. 以ELISA方法检测, Fab'-LDM偶联物保留了单抗Fab′片段对肝癌22(H22)细胞的免疫结合活性; 以MTT法测定, Fab'-LDM偶联物对肝癌22细胞显示出更强的细胞毒性. 动物体内试验观察对小鼠移植性肝癌22的疗效, 小鼠皮下接种肿瘤, 24 h后开始给药(静脉注射2次, 分别在接种后1和8天), Fab'-LDM偶联物0.025, 0.05和0.10 mg/kg剂量组的抑瘤率分别为76.7%, 93.3%和94.8%, 而游离LDM 0.05 mg/kg的抑瘤率为76.1%; 另一批实验于接种肿瘤96 h后开始给药(静脉注射2次, 分别在接种后4和11天), Fab'-LDM偶联物0.025和0.05 mg/kg组的抑瘤率分别为74.2%和80.9%, 而LDM 0.05 mg/kg组的抑瘤率为60.5%. Fab'-LDM偶联物0.05 mg/kg可显著延长荷瘤小鼠的生存时间, 与同等剂量的游离LDM相比, 延长生存时间的效果更强(P < 0.05). 以上结果表明, 以Ⅳ型胶原酶为靶点的小型化单抗免疫偶联物在肿瘤的实验治疗中有显著的疗效.     

γ-多聚谷氨酸的生物合成及其相关基因

综述了γ 多聚谷氨酸 (γ PGA)的研究进展。γ PGA是一种高分子可降解生物材料 ,目前 ,高产菌株的产量为 5 4 45～ 5 8 0 8g L ,多用E 培养基 ,发酵温度为 37℃ ,影响产率的因素为碳源、NaCl浓度、通气量和金属离子。用超滤和乙醇沉淀的方法提取分离纯化γ PGA。讨论了γ PGA生物合成机制及其相关基因的克隆、定位和功能。最后简述了γ PGA的应用与展望。