螺旋藻耐盐相关基因启动子区功能分析

文章利用绿色荧光蛋白基因作为报告基因,研究2个螺旋藻耐盐相关基因启动子区域的功能。通过启动子预测软件预测螺旋藻耐盐相关基因5′端非翻译区的启动子结构,用Primer3.0程序在线设计引物,以pMD18-T载体和pUC18载体克隆螺旋藻启动子序列、gfp和卡那霉素抗性基因,将螺旋藻启动子-GFP基因-卡那霉素抗性基因(pro-gfp-kanr)三联DNA片段克隆至pKW1188载体,并将该重组质粒pKW1188::pro::gfp::kanr转化至受体菌集胞藻6803,激光共聚焦显微镜观察不同盐浓度培养条件下、不同时间段集胞藻表达GFP的情况。结果显示,通过不同盐浓度和不同时间的诱导,2个螺旋藻启动子在0.4~0.6 mol/L NaCl条件下,培养6~8 h表达的绿色荧光蛋白最多。文章成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因、卡那霉素抗性基因为选择标记、集胞藻6803作为外源基因表达受体,进行螺旋藻耐盐相关基因功能研究的平台;另外,从螺旋藻启动子能被盐诱导大量表达GFP的结果看,与启动子相关的螺旋藻基因很可能与螺旋藻的耐盐性相关。     

ZNF268基因启动子区的克隆及功能分析

锌指基因家族是人体中最大的基因家族,它参与细胞分化、胚胎发育,并与许多疾病的发生相关。人类ZNF268基因是一个在人胚肝中特异性表达的C2H2型锌指基因,并可能在人的早期肝脏发育中起重要作用。为了研究ZNF268基因表达调控的分子机制,以正常人总基因组为模板PCR扩增了ZNF268基因的5′调控区2533bp片段,并将此片段插入启动子缺失的EGFP(增强型绿色荧光蛋白)载体构建了重组质粒pZNF268—EGFP。用脂质体介导的方法将pZNF268—EGFP转染NIH／3T3、COS7、K562、HeLa4个细胞系。在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光的表达,发现在每个细胞系中,转染了重组质粒pZNF268—EGFP的细胞均有荧光表达,但其起始表达时间均晚于转染了阳性对照质粒pEGFP—C1的细胞且荧光较弱。这表明ZNF268基因的5′调控区2．5kb片段是一个有功能的启动子,但该启动子与CMV启动子相比活性较弱。选择易培养的HeLa细胞系用于缺失研究。将一系列5′端—2456bp至—20bp缺失、3′端均为 77bp的缺失片段插入启动子缺失的CAT(氯酶素酰胺转移酶)载体构建了一系列重组质粒。将这些重组质粒转染HeLa细胞系进行缺失分析,并通过共转染pCMV—Sport—βgal质粒校正转染效率。结果表明,ZNF268启动子—2456～—1639bp区域可能含有正调控元件,—1244～—1013bp和—525～—156bp区域可能含有负调控元件,ZNF268启动子激活转录的一个重要区域位于—156～—20bp。     

儿童孤独症相关基因NRXN1β启动子功能分析

Neurexins是神经特异性突触蛋白,Neurexin1β结构的异常与孤独症密切相关。为分析孤独症相关基因NRXN1β最小启动子和调节基因转录的功能元件,本文构建了含NRXN1β基因上游调控区不同区域的荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞后,利用检测双荧光素酶报告基因的转录活性以确定NRXN1β基因最小启动子区,进而筛选出相应的显著增强或抑制报告基因活性的功能区;同时,为鉴定顺式作用元件,利用基因定点突变技术对基因功能区内和临近DNA序列进行连续的碱基突变;最后,采用转录因子预测工具对启动子功能区内的转录调控元件进行分析。结果首次发现NRXN1β最小启动子区位于?88~+156 bp,?88~?73 bp和+156~+149 bp可增强启动子活性,+229~+419 bp可抑制启动子活性,且?84~?63 bp为能够显著性增强启动子活性的顺式作用元件,该区域可能存在DBP(Albumin D-site-binding protein,DBP)和ABF1(Autonomously replicating sequence-binding factor 1,ABF1)两个转录因子结合位点。     

藤稔葡萄花发育相关基因启动子的克隆及功能分析

采用基于热不对称交错式PCR的基因组步移法,从藤稔葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)的基因组总DNA中扩增花发育相关基因FT、FLC、AP3和AG的启动子上游序列片段,并通过序列分析及PlantCARE在线预测对FT、FLC和AP3启动子片段的序列及顺式调控作用元件和功能进行了分析.扩增结果表明:AG的第1轮扩增产物无明显条带,第2轮扩增产物条带弥散,不能用于序列分析及顺式调控作用元件和功能分析;FT、FLC和AP3基因2轮扩增产物均有特异条带,FT、FLC和AP3启动子序列的实际长度分别为1 470、1 698和1 061 bp,GenBank登录号分别为HM192806、HM192805和HM192804.PlantCARE在线预测结果表明:FT、FLC和AP3启动子片段中均含有TATA-box、CAAT-box等启动子的特异表达元件及光响应元件、真菌刺激响应元件、MYB结合位点等多个顺式调控作用元件,共同受真菌刺激、MYB和光等因素的调控;FT、FLC和AP3均可能在花的分生组织中表达,且FT和AP3还可能在胚乳中表达.根据研究结果推测:FT、FLC和AP3基因的启动子序列片段中均存在多种诱导响应元件,可能均为诱导型启动子.     

嗜盐菌耐盐机制相关基因的研究进展

嗜盐微生物能够在高盐环境中生存,其耐盐机制一直是微生物学家研究的热点。目前嗜盐微生物耐盐机制的研究主要集中在细胞吸K+排Na+作用、胞内积累小分子相容性溶质及嗜盐酶的氨基酸组成特性三个方面。文章从基因水平综述了嗜盐菌的耐盐机制,并对其在高盐废水处理上的应用进行讨论与展望。     

盐爪爪耐盐相关基因的cDNA-AFLP分析

以不同浓度NaCl(0、100、200、300、400和500 mmol/L)处理生长了4周的盐爪爪(Kalidium foliatum),48h后取其幼嫩叶片用于RNA提取,并进行了cDNA-AFLP表达差异分析.结果表明,用256对引物扩增出连续性差异片段155条,按照NaCl浓度升高的顺序,划分为8种差异带类型,即强→弱"、弱→强"、有→无"、无→有"、有→无→有"、无→有→无"、强→弱→强"和弱→强→弱".测序后获得176个新表达序列标签(ESTs),已将长度大于100 bp的162个ESTs登录到GenBank,登录号为HO205290~HO205450.经BLAST序列比对分析发现,盐爪爪的耐盐性可能与能量、新陈代谢、防御、转运、转录和翻译等相关蛋白有关.     

绵羊Myostatin基因启动子的功能分析

相比于Myostatin基因的作用机制而言, 对Myostatin基因转录和表达的调控机制了解很少. 为了更好地了解Myostatin基因5’调控区的结构和功能, 深入研究Myostatin基因的转录调控机制, 在最近的研究中克隆了绵羊Myostatin基因的启动子(Pro)序列(GenBank 登录号为AY918121). 进一步以EGFP为报告基因, 构建了各种长度的野生型MSTNPro^W-EGFP载体和E-box元件突变型MSTNPro^EM-EGFP载体, 通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系或绵羊成纤维细胞后, 对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行荧光定量分析而比较不同条件下绵羊Myostatin基因启动子的转录调控活性. 结果表明, 0.3~1.2 kb的绵羊Myostatin基因启动子都能不同程度地驱动EGFP在C2C12细胞中的转录和表达, 其中1.2 kb片段的转录调控活性最高. 然 而, 将绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体转染绵羊成纤维细胞后并未观察到EGFP的表达, 说明Myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性. 对稳定转染绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体的C2C12细胞进行荧光分析, 结果表明细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin基因的转录和表达. 在C2C12分化状态下, 1.2 kb野生型绵羊Myostatin基因启动子的活性比成肌状态时显著升高, 而1.2 kb E(3+5+7)突变型Myostatin基因启动子的活性在C2C12分化前后并未表现出差别. 这一结果暗示肌肉调控因子MyoD可能是通过与E-box结合而引起Myostatin基因在C2C12分化和生长状态时转录和表达差异的一个原因.     

柽柳bZIP基因调控耐盐相关基因的表达

本研究探讨了柽柳（Tamarixhispida）bZIP（basicleucine zipper）基因对抗逆基因表达的调控。我们比较了非盐胁迫和盐胁迫条件下非转基因和转bZIP基因植株的SOD、POD、ATPase、GST、LTP和LEA等基因表达量的变化。结果表明,在非胁迫条件下,bZIP转录因子可能直接调控了poxN1、TOBPXD、TOBLTP和ltp1基因的表达,而其他基因的表达可能不受bZIP转录因子的直接调控。在盐胁迫下,bZIP转录因子能够直接或间接地调控部分抗逆基因的表达,使它们的表达量显著增强。     

红树林耐盐相关基因转化水稻的研究

运用农杆菌介导法将红树林耐盐相关基因mangrin转入粳稻品种‘日本晴’中,通过GUS基因检测愈伤组织转化率,确定农杆菌菌液浓度OD600为0.5,浸染时间30min,共培养时间3d为最佳转化体系;经潮霉菌筛选,获得抗性再生植株。通过PCR扩增检测、Southern blot分析和GUS基因活性检测,结果表明,mangrin基因整合到再生水稻的染色体DNA上。耐盐性测定结果表明,转基因植株在200mmol/L NaCl胁迫下,成活率保持在83.3%,株高增长20%~40%,mangrin基因能提高转基因水稻对盐胁迫的抗性。     

大豆耐盐机理及相关基因分子标记

大豆耐盐涉及多种生理代谢途径.耐盐大豆能够通过Cl-排除、控制Na 的吸收和转运、合成渗透调节物质、改变细胞膜膜脂组分及相关酶类的活性等多种形式来适应盐胁迫;野生大豆群体具有盐腺,从形态结构上适应盐逆境;大豆-根瘤菌共生体在盐胁迫下通过互作来提高整体的耐盐性.分子生物学技术应用于大豆耐盐研究,已获得了一些与耐盐相关基因连锁的分子标记.广泛搜集筛选大豆栽培种和野生种资源,利用分子生物学技术和基因工程提高大豆耐盐性,将成为未来大豆耐盐研究的主要内容.     

大豆耐盐机理及相关基因分子标记

大豆耐盐涉及多种生理代谢途径。耐盐大豆能够通过Cl-排除、控制Na+的吸收和转运、合成渗透调节物质、改变细胞膜膜脂组分及相关酶类的活性等多种形式来适应盐胁迫;野生大豆群体具有盐腺,从形态结构上适应盐逆境;大豆-根瘤菌共生体在盐胁迫下通过互作来提高整体的耐盐性。分子生物学技术应用于大豆耐盐研究,已获得了一些与耐盐相关基因连锁的分子标记。广泛搜集筛选大豆栽培种和野生种资源,利用分子生物学技术和基因工程提高大豆耐盐性,将成为未来大豆耐盐研究的主要内容。     

植物耐盐相关基因：SOS基因家族研究进展

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素,也是现代生物科学迫切需要解决的问题。利用拟南芥研究植物耐盐相关基因成为该领域的研究热点。几年来,该领域研究成果斐然。本文就SOS基因家族的三个耐盐基因SOS1、SOS2和SOS3的克隆、功能及相互关系作一概要的评述。 Abstract:The soil salination is a significant abiotic stress for agricultural production and ecological environment. The research on salt tolerance represents an important part for basic plant biology. Genetic analysis of salt tolerance genes in Arabidopsis has become a central issue in this research areas. In recent years, efforts from some laboratories in the world have led to some significant progresses in this field. In this paper, we will review the progress in salt tolerance genes SOS(salt overly sensitive):SOS1,SOS2 and SOS3.     

杜氏盐藻rbcS启动子的克隆和功能分析

为提高转基因盐藻的表达效率,利用基因组步行方法和巢式PCR,从盐藻中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的小亚基基因rbcS 的5'上游调控序列,并对其进行序列分析和转基因功能分析。采用Dra I、EcoR V、Pvu II和Stu I四种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA,并与接头连接,构建基因组步行文库GWL 1、GWL 2、GWL 3和GWL 4;设计特异引物从这四种文库中扩增rbcS基因的5'上游调控序列。在GWL 1、GWL 4中分别扩增出约1.2 kb的片段。对该序列的分析表明,它的3'端与已知盐藻rbcS cDNA 的5'端序列完全一致,说明是该基因的5'端上游区,并且包含多个与转录调控有关的保守序列（如TATA-box、CAAT-box）,富含GT的重复序列。此序列EcoR I下游的片段与除草剂抗性基因bar相融合,构建表达载体,电击法转化盐藻。通过对转化藻株的抗性筛选以及PCR和Southern blot检测,表明该区域能驱动外源基因bar在转基因盐藻中的表达,推断是盐藻rbcS基因的启动子调控区。     

芝麻NAC转录因子基因SiNAC77的克隆及耐盐功能分析

NAC转录因子在植物生长发育及盐胁迫响应过程中具有重要的调控作用。芝麻SiNAC77参与盐胁迫响应过程。克隆芝麻SiNAC77并分析其耐盐功能,为芝麻耐盐育种提供分子基础和基因资源。克隆SiNAC77的全长CDS序列,利用生物信息学软件对其基因序列和氨基酸序列特征进行分析。构建SiNAC77过表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥。对过表达株系的耐盐表型和生理生化指标进行分析。结果表明,成功克隆了长度为1 008 bp的SiNAC77 CDS序列,编码335个氨基酸,相对分子量为135.93 kD,预测等电点为4.91,含有33个潜在的磷酸化位点;启动子区域含有MBS、STRE、ARE、ABRE和TCA等多个非生物胁迫及激素响应元件。成功构建了SiNAC77过表达载体,并转化拟南芥,获得12个独立的转基因阳性株系。在盐胁迫下,与野生型拟南芥相比,过表达株系的种子发芽率、初生根长度、鲜重均显著提高,转基因株系中Na⁺/K⁺和相对MDA含量显著降低,相对SOD和POD抗氧化酶活性则显著增强。过表达芝麻SiNAC77可以增强抗氧化酶活性,减少离子毒害...     

MAL1基因启动子区的克隆及其在大肠杆菌中的启动功能分析

目的：MAL1基因启动子区在原核生物大肠杆菌中是否有双向启动外源基因的功能。方法：利用PCR扩增MAL1基因启动子区,将不同方向的MAL1基因启动子区后接上Zeocin基因,构建成重组报告质粒,转化大肠杆菌DH5α,验证该启动子区是否双向都具有启动外源基因的功能。结果：将含不同方向启动子区的重组质粒PUCMZ1和PUCMZ2,转化大肠杆菌,转化子均有Zeoein抗性。结论：证明了MAL1结构基因上游启动子区在原核生物大肠杆菌中具有双向启动的功能,且3′-5′方向的启动能力强于5′-3′方向。     

大豆耐盐相关QTLs鉴定和功能基因研究进展

大豆(Glycine max (L.) Merill)是重要的粮食作物和经济作物,盐胁迫能造成大豆产量的大幅度降低。本文综述了通过正向遗传学手段获得的大豆耐盐数量性状位点(Quantitative trait locus, QTL)以及通过反向遗传学方法获得的大豆耐盐功能基因方面的研究进展。目前,正向遗传学发掘基因主要有图位克隆(Map-based cloning)和全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS)两种方案,其中通过图位克隆在大豆中已经获得了6个耐盐QTL位点并且定位了1个重要的耐盐基因;利用GWAS在大豆中获得了1个耐盐功能基因。利用反向遗传学在大豆中获得了大量的耐盐相关功能基因并在模式植物中验证了其功能,主要包括离子转运蛋白基因和转录因子基因。这些研究为揭示大豆耐盐分子机制以及通过分子标记辅助育种或转基因技术创制耐盐大豆奠定了基础。     

高羊茅FaChit1基因启动子的功能分析

用含有不同长度FaChitl基因启动子区域与GUS基因融合构建植物表达载体pFaChitlP—I、pFaChitlP-Ⅱ以及pFaChitlP-Ⅲ并分别对烟草进行转化,经真菌激发子、干旱、机械损伤以及乙烯等多种胁迫处理后测定GUS活性。启动子缺失分析实验结果显示,真菌激发子对FaChitl基因启动子所介导的GUS诱导表达效果最强,而机械损伤只能微弱地诱导GL靥基因表达;FaChitl基因启动子-651bp以内的序列均能介导GUS基因的诱导表达,同时-935bp与-233bp之间的区域是该启动子响应真菌激发子、乙烯以及机械损伤胁迫所必需的。表明FaChitl启动子是一个多胁迫诱导型启动子。     

拟南芥atslA基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出atslA基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,atslA基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。     

空间飞行水稻pi-hit-1基因启动子功能分析

pi-hit-1基因是本实验室通过空间诱变找到的一个水稻新基因。为了对pi-hit-1基因启动子结构和功能进行研究,首先使用植物启动子分析数据库(PlantProm DB-TSSP,TFSEARCH,PLACE及PlantCARE)对该基因转录调控区序列进行预测分析,结果显示该基因上游调控区存在多个顺式元件,主要集中在翻译起始位点前300bp的区域,转录起始位点位于翻译起始位点前100bp,在转录起始位点前132bp存在TATA box元件。凝胶电泳迁移率实验(EMSA)发现翻译起始位点上游约300bp存在转录因子特异结合位点,为该基因的核心启动子,这与预测结果一致。采用系统生物学的方法研究水稻新基因pi-hit-1启动子结构,发现了该基因的核心启动子元件,为研究空间环境如何影响基因的转录调控提供了重要依据。     

人类RELM-beta基因启动子的结构与功能分析

为克隆人类抵抗素样分子β（resistin-like molecule beta, RELMβ）基因的上游启动子序列,并观察其不同截短片段的启动子活性,以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增方法获得-871～+50 bp、-729～+50 bp、-471～+50 bp、-438～+50 bp、-371～+50 bp大小的RELMβ启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic载体,构建荧光素酶报告基因载体,并制备转录因子CDX-2结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体的介导下,报告基因载体分别瞬时转染人胚肾293细胞、结肠癌HCT116和SW480细胞、宫颈癌HeLa细胞.结果发现,各RELMβ启动子片段在293、HCT116、SW480细胞中均有活性,但在HeLa细胞中活性缺失;-471～-438 bp区存在RELMβ启动子的核心调控元件.针对该区域CDX-2转录因子结合位点进行突变,能导致RELMβ启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明,该区段能结合CDX-2.结果提示,成功克隆了具有活性的RELMβ启动子序列,CDX-2为其重要的转录因子,为研究RELMβ基因的转录调控机制奠定了实验基础.