荧光偏振技术在肿瘤研究中的应用

1974年英国Cercek等报告,以荧光偏振技术测定癌患者末梢血淋巴细胞的胞浆基质结构程度(structuredness of Cytoplasmic matrix,简称SCM)的改变可用于肿瘤的诊断,由于方法敏感、结果可靠,这一方法遂引起有关方面的广泛注意。作者等将淋巴细胞加入二醋酸荧光素(FDA)溶液中,FDA为无荧光物质,当透入细胞后即被酯酶水解而释出荧光素,测定唇者的荧光偏振度——荧光素分子空间排列的有序程度——即可间接     

癌血清对小鼠SCM反应的特异抑制作用

癌血清对小鼠脾淋巴细胞SCM反应的抑制作用可用于区别健康者、非癌患者和癌症。前者RR_(SCM)<80—85%,后者>90%。癌血清的这种抑制作用呈浓度和时间相关,无种属特异性,而仅与肿瘤的恶性与否相关。在癌症早期可出现这一抑制作用,并随癌肿的移去而消失。与Cercek经典方法或同位素参入等方法相比,本方法在易判性、可靠性、简便性方面都具优点、有理论研究和实用价值。     

用氚化胸腺嘧啶核苷测定淋巴细胞转化——Ⅰ.两种国产纤维滤片的比较

我们比较了两种国产纤维滤片,无论对小分子氚化胸腺嘧啶核苷、大分子~(?)H-DNA 的测量效率,还是复管变异情况,均以玻璃纤维滤片优于醋酸纤维滤片。国产49型和69型玻璃纤维滤片性能相近,以49型重迭测定性能良好及经济。玻璃纤维滤片的洗涤方法,无论是分离淋巴细胞培养还是全血培养,均以蒸馏水过滤,5%三氯醋酸破坏细胞沉淀DNA,无水乙醇脱色和脱水的处理方法为佳。滤片贴在测量杯壁内测定,能提高测量效率,节约了闪烁液,避免了污染闪烁液处理的麻烦。但几何角度影响很大,需进一步研究。     

用氚化胸腺嘧啶核苷测定淋巴细胞转化——Ⅰ.两种国产纤维滤片的比较

我们比较了两种国产纤维滤片,无论对小分子氚化胸腺嘧啶核苷、大分子~3H-DNA的测量效率,还是复管变异情况,均以玻璃纤维滤片优于醋酸纤维滤片。国产49型和69型玻璃纤维滤片性能相近,以49型重迭测定性能良好及经济。玻璃纤维滤片的洗涤方法,无论是分离淋巴细胞培养还是全血培养,均以蒸馏水过滤,5%三氯醋酸破坏细胞沉淀DNA,无水乙醇脱色和脱水的处理方法为佳。滤片贴在测量杯壁内测定,能提高测量效率,节约了闪烁液,避免了污染闪烁液处理的麻烦。但几何角度影响很大,需进一步研究。     

植物组织中ATP、ADP、AMP量的测定及能荷指标

用萤火虫发光器中的萤光素-萤光素酶测定腺三磷是最专一而灵敏的方法。常用来作细胞(花粉、精子)和以毫克计的组织或细胞器中的ATP含量的分析。萤光素-萤光素酶不仅可用于ATP的专一测定,如借助特     

免疫诊断细胞方法(续完)

<正>(二)测定被刺激淋巴细胞上清液中淋巴因子活性的方法 1、白细胞移动抑制因子的鉴定方法。 籍指示细胞移动抑制来测定上清液淋巴因子活性。为此可用第六章的方法。 (1)白细胞移动抑制的间接反应。 指示细胞 使用人白细胞悬液或豚鼠腹腔渗出液巨噬细胞判定上清液白细胞移动抑制因子的活性。制备这些悬液与制备抑制白细胞移动的直接反应相同。可使用精制巨噬细胞或多核白细胞悬液,因为正是这些细胞对MIF起反应。因此,如果不用精制多核白细胞,则必须注意用于指示白细胞悬液的细胞组成。淋巴细胞占多数的悬液不能用于检     

魁蚶幼贝对筒柱藻滤食效应的初步研究

采用实验生态学方法和"捕食者-猎物"的捕食模型,研究了黑暗条件下魁蚶(Anadara broughtonii)幼贝对筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)的滤食效应,测定了5种藻液浓度(30×107~150×107cells/L)及4个温度梯度(10℃、15℃、20℃和25℃)下魁蚶对饵料生物的滤食能力、功能反应类型和滤藻效应特征,并分别建立Holling圆盘方程。同时研究了水温20℃时魁蚶个体间的滤食干扰反应,建立了藻液浓度和魁蚶自身密度的联合反应方程。实验发现,水温20℃条件下,魁蚶幼贝对筒柱藻的平均滤食速率随着藻液浓度的增加而显著增大(P0.05),且0~4 h时段内的滤食速率显著高于其他时段。魁蚶滤食筒柱藻的功能反应属Holling-Ⅱ型,拟合圆盘方程为Na=1.0195N_0/1+0.002039N_0滤食功能系数为1.019 5,极限法推出壳长30~35 mm的魁蚶对筒柱藻的日均最大滤食量约为500×107 cells/L;10~25℃条件下,魁蚶的平均滤食速率和滤食功能反应系数随温度升高呈现先升高后下降的变化趋势,并于20℃时达到最大值,推测20℃是其最佳摄食温度。魁蚶的滤食效应存在较强的个体间干扰反应,平均滤食量和滤食作用率均随幼贝密度的增加而下降,且魁蚶滤食筒柱藻的功能反应与幼贝密度的关系可用幂函数方程E=0.730 8P﹣1.068表示,由此建立了魁蚶幼贝密度与筒柱藻藻液浓度之间的联合反应方程N_a=0.7451P~(-0.0684)N_0/1+0.0020N0。结果表明,水温20℃时,魁蚶幼贝具有较强的潜在滤食能力,其平均滤食量和滤食作用率与幼贝密度间存在明显的"负密度效应"特征。     

脑内单胺神经递质萤光组织化学技术的某些改良

Falck—Hillarp 发展的萤光组织化学技术成功地显示出神经组织中含单胺类物质的神经元。使之在萤光显微镜下可直接观察和测定这些物质在细胞水平的定位和定量。近十多年来,萤光组织化学技术在神经学的研究中被广泛采用,并有一些改良。我们曾对该技术作过介绍。本文仅根据我们对该技术的某些改良作一报道。     

cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建

目的:构建含有cAMP反应元件(CRE)的萤光素酶报告基因载体。方法:以含有gal4位点的萤光素酶报告基因质粒为模板,利用PCR方法,在去除gal4位点的同时,连入4个CRE元件得到pCRE-luc;将该载体与G蛋白偶联受体(GPCR)共转染人胚肾细胞HEK293,测定萤光素酶活性;应用蛋白激酶A(PKA)抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果:pCRE-luc的活性直接相关于GPCR的激活程度,并依赖Gs信号通路。结论:CRE萤光素酶报告基因载体构建成功,可用于检测Gs偶联GPCR的活性,为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。     

脑内单胺神经递质萤光组织化学技术的某些改良

Falck-Hillarp发展的萤光组织化学技术成功地显示出神经组织中含单胺类物质的神经元。使之在萤光显微镜下可直接观察和测定这些物质在细胞水平的定位和定量。近十多年来,萤光组织化学技术在神经学的研究中被广泛采用,并有一些改良。我们曾对该技术作过介绍。本文仅根据我们对该技术的某些改良作一报道。     

LRP16对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对LRP16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建LRP16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .将LRP16基因的表达载体转染MCF 7细胞 ,测定过表达LRP16对细胞的生长特性的影响 .17β E2 使MCF 7细胞中LRP16mRNA表达水平增加 ,增加幅度未显示出 17β E2 培养时间和剂量的依赖性 .pS0 与ERα表达载体共转染细胞的相对萤光素酶活性较非共转染组 (对照组 )及pS0 ERβ表载体共转染组升高 5～ 10倍 .LRP16基因过表达促进MCF 7细胞的增殖 .研究表明 ,雌激素可能通过ERα上调乳腺癌MCF 7细胞LRP16基因的表达并促进细胞增殖     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA进行了顺序分析。片段用量为0.16A_(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建简

目的：构建含有cAMP反应元件（CRE）的萤光素酶报告基因载体。方法：以含有ga14位点的萤光素酶报告基因质粒为模板,利用PCR方法,在去除ga14位点的同时,连入4个CRE元件得到pCRE-luc;将该载体与G蛋白偶联受体（GPCR）共转染人胚肾细胞HEK293,测定萤光素酶活性;应用蛋白激酶A（PKA）抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果：pCRE-luc的活性直接相关于GPCR的激活程度,并依赖Gs信号通路。结论：CRE萤光素酶报告基因载体构建成功,可用于检测Gs偶联GPCR的活性,为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-GIy-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase 酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA 进行了顺序分析。片段用量为0.16A~(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

Sp1真核表达载体的构建及对USP22基因转录活性的影响

目的 克隆人sp1基因,构建真核表细胞达载体pVAX-Sp1,研究其对USP22基因转录活性的影响.方法 Trizol试剂快速提取人肝癌细胞株HepG2总RNA,经RT-PCR扩增Sp1基因序列,与pVAX1真核表达载体连接;测序、酶切鉴定重组载体;pVAX1-Sp1与含USP22启动子的萤光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性表达.结果 测序及酶切结果显示重组质粒pVAX1-Sp1构建成功;高表达sp1可使USP22启动子的转录活性降低（P＜0.01）.结论 成功构建了sp1真核表达质粒,sp1对USP22启动子具有转录抑制作用.     

杂交水稻苗期叶绿体希尔反应活性研究

本文利用薄膜氧电极法,测定了五套杂交水稻组合的杂种和亲本的叶绿体破碎膜的悬浮液(以下简写作叶绿体液)和细胞匀浆液(简写作细胞液)的光下放氧活性及其亲本间的互补效应,发现具有优势的杂种其叶绿体液和细胞液的希尔反应活性都较其亲本的平均值为高,即有叶绿体希尔反应活性杂种优势表现;另外将两亲本叶绿体液或细胞液等量混合后测定,也较其亲本的平均值要高,即有互补作用表现。且细胞匀浆互补效应较叶绿体液的互补效应要明显。我们认为,叶绿体希尔反应活性的杂种优势和互补作用表现,无论是叶绿体液还是细胞液,都可以作为杂种优势预测的一个参考指标;在杂种优势机理探讨方面有一定的价值。而且应用细胞匀浆互补比用叶绿体互补稳定可靠,简便易行。     

DPH标记细胞膜的动力学与膜脂流动性的荧光偏振校正测量

用稳态荧光技术测得经过校正的荧光成分,由此算出用DPH标记的细胞膜的偏振度。方法是作荧光偏振值在随时间变化的曲线,将其外推至零标记时间求出该时间的荧光偏振值。用此法测定了艾氏腹水癌细胞的膜流动性。结果表明流动性比用整个细胞测得之值小,说明膜脂的有序程度和包装密度比胞浆中的脂大。实验结果和用三房空模型分析所得的理论值符合较好,提示荧光探剂的标记过程主要受分子扩散所控制。     

测量培养细胞鲜重和干重的新方法

要精确测定细胞的鲜重和干重,需要最大限度地了解悬浮培养的植物细胞生长的情况。这两种重量一般通过抽滤后干燥的方法测得。然而,抽滤并不总是能除去间隙中所有的水,并且用抽滤法测出的鲜重值常有较大的差异。华盛顿州立大学的科学家Ｄ．Ｒ．Ｍｉｌｌｓ和Ｊ．Ｍ．Ｌｅｅ描述了一种测量植物培养细胞鲜重和干重的更为精确的快速方法。这个方法包括（１）向一个已知重量的微量离心管中加入１ｍｌ悬浮培养液,并称重;（２）在管的尖端切一条约３ｍｍ深的裂缝;（３）把这个管插在另一个离心管中;（４）将整个装置放入一个５０ｍｌ的离心管…     

介绍两种自制的简易细胞电泳装置

细胞电泳技术,是通过测定细胞表面电荷的性质和密度,来研究细胞表面的结构和功能变化的一种精细的和灵敏的生物物理学方法。在医学范围内曾应用于研究癌细胞表面特性和表面分子结构的改变;抗原-抗体反应过程中细胞表面电荷密度的变化;抗菌素、消毒剂等对细菌表面的组成、结构和功能的影响;病毒与感染细胞的表面结构和功能变化的关系,病毒与感染细胞上特异受体的结合;电离辐射所引起的细胞表面的微结构的破坏、细胞表面酶系统的失活等等。此外,在研究细胞免疫方面,巨噬细胞电泳和淋巴细胞电泳亦能反应出“巨噬细胞电泳缓慢因子”和T淋巴细胞与B淋巴细胞的百分率。总之,细胞电泳是值得重视的一项     

表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立

目的:构建基于萤光素酶的单次复制人免疫缺陷病毒(HIV)细胞模型,用于抗HIV药物的筛选。方法:构建含萤光素酶报告基因的假型慢病毒质粒,将疱疹性口炎病毒外膜糖蛋白(VSV-G)的表达质粒、HIV-1 Rev蛋白表达质粒、HIV Gag-Pol蛋白表达质粒和含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒共转染HEK 293FT细胞,制备假型慢病毒;在假型慢病毒生产和再感染新鲜HEK 293FT细胞的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂(如AZT),检测再感染的细胞中萤光素酶的表达水平,从而判断药物对HIV的抑制作用。结果:构建了含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc;利用已知抗HIV药物AZT进行测试,发现HIV药物处理组细胞中萤光素酶活性远低于对照组。结论:建立了基于萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型,该系统使用单次复制的报告病毒,具有良好的安全性,而使用萤光素酶基因作为报告基因使该系统具备极高的敏感性,该系统适合于进行高通量药物筛选。