巨噬细胞源性神经营养因子的纯化和鉴定

Macrophage-derived neurotrophic factor (M phi DNF) is purified from macrophage conditioned medium by a procedure consisting of column chromatography with Sephacryl S-100-HR, high-performance liquid chromatography (HPLC), and a final step using reverse-phase HPLC. The product shows a single protein band in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. It has a molecular weight of 60.5 kD and an isoelectric point of pI 5.1 and contains more leucine, lysine, glutamine and aspartic acids in its amino acid composition. Purified M phi DNF can promote the survival, activity, and neurite outgrowth of cultured cerebellar cortical neurons and that this effect reaches maximal levels with concentrations of the M phi DNF ranging from 500-1000 ng/ml.     

人胶源神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

胶源神经营养因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是大鼠B49细胞系中分离纯化得到的一种蛋白质^[1],由于其对多巴胺神经元的专一性的神经营养作用而被发现。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸组成,具有两个N-糖基化位点。它属于TGF-β基因家族但与该家族其它成员的氨基酸序列同源性仅为20%,可能是一个新的亚家族。最近研究表明,它对发育中的运动神经元也有很强的神经营养作用^[1]。对啮齿类^[3,4],灵长类的弥猴^[5]的活体试验表明,胶源神经营养因子是一种治疗神经退化发夹知病如帕金森氏症、肌萎缩性脊髓索硬化症等的非常有效的潜在药物。由于GDNF在体内含量极低而且公在发育早期表达,因而只有通过基因工程方法才能获得大量的GDNF。本文报道采用PCR方法从中国入基因组DNA 中扩增出编码GDNF的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达。这为进一步研究GDNF的结构和生物学功能打下了坚实的基础。     

一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达

利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4 Kan序列片段 ,与pPICZα重组 ,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4 Kan序列 ,能整合到酵母染色体上 ,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点。将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(35 7bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式 ,分别构建含有 1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体 ,电击法转化毕赤酵母GS115菌株 ,用G4 18和Zeocin筛选转化子 ,筛选到的阳性转化子用 0 5 %甲醇诱导 ,获得分泌型表达。表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约 14kD。多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒 ,ELISA和Westernblot检测表明 :表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合 ,证实该表达蛋白具有hBDNF的免疫原性     

人脑源性神经营养因子基因表达

用聚合酶链式反应(PCR)从人基因组DNA中扩增了人脑源性神经营养因子(hBDNF) cDNA和hBDNF成熟蛋白编码片段,分别克隆到pUC18中.经测序确认两个插入片段序列正确.hBDNF cDNA在CMV启动子控制下在NIH/3T3细胞中表达,用RT-PCR检测转染细胞确有BDNF mRNA存在.BDNF成熟蛋白编码序列在T7启动子控制下在E.coli中表达,SDS-PAGE表明,BDNF得到表达,以包涵体形式存在.     

人脑源性神经营养因子cDNA在COS7细胞中的表达及活性…

本文从质粒Ｍ１３ｍｐ１８－ｈＢＤＮＦ中酶切回收入及源性神经营养因子（ｈＢＤＮＦ）全长基因,构建真核表达载体ｐＣＭＶ４－ｈＢＤＮＦ。利用脂质体的方法转染ＣＯＳ７细胞,对转染后的ＣＯＳ７细胞提取ＲＮＡ进行狭缝杂交分析和免疫细胞化学反应,分别从转录及翻译水平上检测ＢＤＮＦ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达。实验还证实在ＣＯＳ７细胞中表达的ｈＢＤＦ蛋白可分泌至胞外并可促进中脑黑质细胞的发育和生长,具有良好的生物学     

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达何晓龙,路长林,王成海（第二军医大学神经生物学教研室,上海２００４３３）关键词神经营养因子;基因克隆脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｉｃ…ｉ。血。ｔｏｒ,ＢＤ贾助是Ｂａｄｅ等人...     

脑源性神经营养因子前体蛋白生物学效应研究进展

神经营养因子是一类分泌性多肽类生长因子,可促进中枢和外周神经元的生长、存活以及分化,但其前体分子却具有不同的生物学活性,也有着不同的受体以及细胞内信号通路。本文对近年来关于脑源性神经营养因子前体蛋白的研究予以综述,着重讨论其在神经损伤与情绪障碍和神经退行性变疾病模型中的作用。     

胶质细胞源神经营养因子基因克隆及产物纯化

用PCR方法从人基因组DNA中扩增出胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的编码序列, 使它在E.coli中表达并纯化了重组GDNF.     

新型载体蛋白P64K在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

用常规PCR方法从脑膜炎球菌中克隆出P64K基因,构建重组质粒pET28a-P64K转化BL21(DE3)宿主菌,经眦诱导表达筛选P64K蛋白的高表达菌株。结果证实P64K蛋白为胞内可溶性表达,表达量约占胞内总蛋白的30％。重组P64K蛋白经Butyl疏水柱、G200分子筛柱和Q阴离子柱三步层析后纯度达到95％以上,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的可溶性表达

载脂蛋白AI米兰突变体(apoliproteinA-I-Milano ,AIM)是载脂蛋白AI的天然突变体,具有比载脂蛋白AI更强的抗动脉粥样硬化症的作用。将AIM基因N_末端的氨基酸密码子优化后,克隆至表达载体pET2 2b ,重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达。AIM以可溶形式表达,约占菌体总蛋白的38%。表达产物经ButylSepharose 4F .F疏水层析和QSepharoseH .P .阴离子交换层析后,再用Vivaspin2 0 (30 0 0 0MW)进行超滤,AIM单体的纯度达95 %以上。AIM单体与脂结合活性表明,AIM单体结合脂的速度比apoA_I慢,但结合脂的量比apoA_I高。这项研究为AIM的结构和功能,特别是临床应用研究奠定了基础。     

胶质细胞衍生的神经营养因子成熟肽基因的克隆、表达及纯化的研究

通过ＰＣＲ的方法克隆了胶质细胞衍生的神经营养因子（ｇｌｉａｃｅｌ－ｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕ－ｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）成熟肽的基因,并将其连接到Ｅ．ｃｏｌｉ高效表达载体ｐＥＴ１６ｂ,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效表达．表达蛋白占菌体总蛋白２１％以上,以包涵体形式存在,经体外复性后用金属螯合亲和层析的方法得到具有较高纯度和活性ｒｈＧＤＮＦ．     

白细胞介素-6在工程菌分批培养中的高效表达及其纯化

在确定了培养基及pH值的基础上,进一步观察了升温诱导过程中有机酸的产生及其对工程菌E.coli DH5α(pHV-hIL-6)生长和rIL-6表达的影响。当有机酸浓度低于70mmol/L以下时,菌密度达到干重2～3.5g/L之间收菌,rIL-6的表达水平为25％～32％;当有机酸浓度达到70mmol/L以上时,工程菌的生长不受影响,而rIL-6的表达明显受抑制。产生的有机酸以乙酸为主。收集菌体后,经过破菌,分离提纯的包涵体,其rIL-6的纯度可达到70％。用GuHCl缓冲液溶解包涵体,样品稀释后经过Q Sepharose F F柱纯化,可得到纯度达95％以上的rIL-6。采用依赖IL-6的小鼠杂交瘤细胞系7TD1及MTT比色法测定生物活性,rIL-6的比活性为2×10~8U/mg。     

E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点,在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点,组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体,使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达,另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a在大肠杆菌中的表达和纯化

为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa) ,对构建的基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa进行了表达条件的优化 .用摇瓶培养 ,rETIa蛋白占菌体总蛋白 4 0 %以上 .经破碎菌体 洗涤包涵体 溶解包涵体 复性初步纯化后 ,再经二步柱层析纯化获得电泳纯的rETIa蛋白 .测定了rETIa对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织型纤溶酶原激活因子缺失突变体 (NTA)的抑制活性 .     

重组人ZP3蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的:用基因工程方法制备重组人ZP3蛋白。方法:以全长人ZP3 cDNA片段为模板,通过PCR扩增出编码人ZP3蛋白不同肽段的cDNA片段,然后将这些cDNA片段分别插入到表达载体pET-19b的NcoⅠ-BamHⅠ或NdeⅠ-BamHⅠ位点内,共构建成6种人ZP3蛋白非融合表达质粒(pEZP3-1~pEZP3-6)和3种人ZP3蛋白融合表达质粒(pEZP3-7~pEZP3-9)。将这9种表达质粒分别转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)感受态细胞并选择出Apr转化子,将Apr转化子接种到NZCYM培养基中(含AP 100μg/mL),在35~37℃振荡培养到对数生长期,加入IPTG至1.0~1.5mmol/L浓度诱导培养3h,离心收集细胞进行SDS-PAGE电泳检测和Western Blot杂交分析。结果:这9种人ZP3蛋白表达质粒在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总细胞蛋白的10~25%,表达产物均以包涵体形式存在。结论:成功构建了重组人ZP3蛋白原核表达系统,为进一步研究和应用人ZP3蛋白打下了基础。     

Neurturin基因克隆及在大肠杆菌中表达

Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ（ Ｎ Ｔ Ｎ）是最近发现的一种与胶质细胞源性神经营养因子（ Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ）相关的神经营养因子．利用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法以染色体 Ｄ Ｎ Ａ 为模板,扩增获得了编码人 Ｎ Ｔ Ｎ 成熟蛋白的基因,将其克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９ 质粒,进行序列分析,结果与文献报道一致．将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体ｐ Ｔｈｉｏ Ｈｉｓ 系统,在宿主菌 Ｔｏｐ１０ 中获得了高效、稳定表达,表达的ｈ Ｎ Ｔ Ｎ 占菌体总蛋白 ２０％ 左右．这为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础．     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.