10828条籼稻全长cDNA的分离和注释

全长cDNA对基因组学和蛋白质组学研究有着非常重要的价值. 以分离籼稻基因组全长cDNA为目标, 从优良的籼稻恢复系明恢63中分离到10828条非冗余的全长cDNA, 其中780条是新的水稻表达序列. 所得到的全长cDNA至少满足以下两个条件之一: (ⅰ) 5′端序列包含粳稻日本晴的全长cDNA所预测的完整的ORF (9078条); (ⅱ) 包含同源蛋白质对应的完整N末端编码序列(6543条). 在分离到的全长cDNA中, 53％的序列比报道的粳稻全长cDNA有更长的5′端非翻译区(5′UTR); 90.28％ (9776条)的序列能定位到粳稻基因组序列上, 92.78％ (10046条)的序列可以定位到籼稻基因组序列上; 8216条序列能与日本晴的全长cDNA序列定位到粳稻基因组序列的同一位置上, 籼粳间cDNA序列的平均相似性为99.2％; 90％以上的全长cDNA能进行GO (gene ontology)分类. 在780条新的cDNA中, 60％以上的找不到任何同源蛋白序列.     

10828条籼稻全长cDNA的分离和注释

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室国家植物基因研究中心谢卡斌、张建伟、向勇等与中国科学院国家基因研究中心冯旗、韩斌等九位专家教授,对此课题作了研究和注释。它们对全长cDNA基因组学和蛋白质组学研究有着非常重要的价值。以分离籼稻基因组全长cDNA为目标,从优良的籼稻恢复系明恢63中分离到10828条非冗余的全长cDNA,其中780条是新的水稻表达序列。[第一段]     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3'和5'基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV S1株全基因组cDNA序列.测序结果表明PRRSV S1株基因组全长15441 bp,包含9个开放式阅读框,5'UTR含有189nt,3'端UTR含有181nt,其中包含30nt Poly (A).基因组序列分析结果显示该病毒与ATCC VR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%.与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3′和5′基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSVS1株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSVS1株基因组全长15441bp,包含9个开放式阅读框,5′UTR含有189nt,3′端UTR含有181nt,其中包含30ntPoly(A)。基因组序列分析结果显示该病毒与ATCCVR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%。与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%。     

柑橘果糖激酶基因的克隆及表达

植物果糖激酶(FRK)在果糖磷酸化中起重要作用。通过PCR技术从温州蜜柑(Citrus　unshiu　Marc.)基因组中扩增得到编码果糖激酶基因的2个基因组DNA片段,分别命名为Cufrk1、Cufrk2,利用RT-PCR从果实中分离到了与Cufrk1外显子序列一致的cDNA序列,并通过RACE技术分离到这个基因的全长cDNA序列,命名为CuFRK1(GenBank号:　AY561840)。Cufrk1与Cufrk2编码氨基酸序列相似性为68%。CuFRK1　cDNA全长为1　459　bp,5'端和3'端的非翻译区分别为167　bp和239　bp,该序列含有一个完整的开放读码框,编码350个氨基酸,蛋白质分子量约为37.5　kD,等电点为5.03,含有2个果糖激酶糖特异结合域及3个ATP结合域,其氨基酸序列与其他植物中已分离的果糖激酶基因相似性在62%￣78%。Northern分析显示,CuFRK1(Cufrk1)与Cufrk2在柑橘幼叶、发育初期果实中表达量较高,在果皮和茎中不表达,在花瓣及成熟果实中表达模式有一定差异。酶活性分析表明,果实中的果糖激酶活性随果实的发育而降低,同时,果实中的果糖不断积累,在果实整个发育过程中果糖含量与果糖激酶活性呈极显著负相关。     

柑橘果糖激酶基因的克隆及表达

植物果糖激酶(FRK)在果糖磷酸化中起重要作用.通过PCR技术从温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.)基因组中扩增得到编码果糖激酶基因的2个基因组DNA片段,分别命名为Cufrk1、Cufrk2,利用RT-PCR从果实中分离到了与Cufrk1外显子序列一致的cDNA序列,并通过RACE技术分离到这个基因的全长cDNA序列,命名为CuFRK1(GenBank号:AY561840).Cufrk1与Cufrk2编码氨基酸序列相似性为68%.CuFRK1 cDNA全长为1 459 bp,5'端和3'端的非翻译区分别为167 bp和239 bp,该序列含有一个完整的开放读码框,编码350个氨基酸,蛋白质分子量约为37.5 kD,等电点为5.03,含有2个果糖激酶糖特异结合域及3个ATP结合域,其氨基酸序列与其他植物中已分离的果糖激酶基因相似性在62%～78%.Northern分析显示,CuFRK1(Cufrk1)与Cufrk2在柑橘幼叶、发育初期果实中表达量较高,在果皮和茎中不表达,在花瓣及成熟果实中表达模式有一定差异.酶活性分析表明,果实中的果糖激酶活性随果实的发育而降低,同时,果实中的果糖不断积累,在果实整个发育过程中果糖含量与果糖激酶活性呈极显著负相关.     

以绵羊MHC区段BAC克隆酶切片段为探针杂交筛选绵羊混合组织cDNA文库

在已知中国美利奴羊MHC(Major histocompatibility complex)区段BAC(Bacterial artificial chromosome)克隆序列信息和预测的基因注释前提下,用位于中国美利奴羊基因组BAC文库MHC区段的6个BAC克隆酶切片段为探针,以噬菌斑原位杂交筛选法筛选中国美利奴羊混合组织cDNA文库(库库杂交),对分离到的cDNA阳性克隆进行全序列测定,并与相应的已知序列信息和基因注释的BAC克隆比对以及在NCBI Blastn数据库中序列相似性检索,旨在验证基因注释结果的准确性和对基因(序列)功能的初步分析。实验中,经过两轮杂交共筛选出27个cDNA阳性克隆(序列),并发现这些序列均可定位到相应的BAC克隆上,且25条序列处在注释基因的外显子部分;在NCBI数据库中经Blastn序列相似性检索发现,23条序列与牛基因的序列相似性最高,且与免疫功能密切相关。     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

球根白丝膜菌γ-actin基因的克隆及表达分析

根据真菌肌动蛋白(actin)基因保守区序列设计引物,用简并PCR法和RACE技术分离得到球根白丝膜菌(Leucocortinarius bulbiger)γ-肌动蛋白基因(Lb-act)的全长cDNA序列。该序列全长为1 357 bp,包含一个1 137 bp的开放阅读框(ORF),编码378个氨基酸,5'端非翻译区(5'UTR)92 bp,3'UTR长度128 bp。Port Param软件在线分析结果表明,该cDNA所编码的蛋白质理论等电点为5.12,相对分子质量为95.022 kD,具有真菌γ-actin基因3个保守特征序列。Blast同源性检索结果表明,Lb-act氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列有较高的相似性,其与双色蜡蘑的肌动蛋白氨基酸序列的亲缘关系最近。Lb-act基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致,验证了该基因作为分子内标的可靠性。     

通过新基因计算机识别与实验确认对NCBI人类基因数据库一些模式参考序列错误的分析与纠正

采用生物信息学分析与实验确认相结合的技术路线,通过所识别的基因在非冗余数据库比对发现了网上公布的计算机注释人类基因组编码序列存在各种类型的多处错误,包括cDNA水平的一个或一段碱基插入、缺失或突变,或是这些错误的不同排列组合,其中以错误插入为多,往往导致编码氨基酸的移码突变。最先举证了NCBIGENOME Annotation Project预测人类新基因的下列错误类型：(1)开放读码框架(0RF)中错误插入一个碱基造成编码氨基酸移码;(2)错误拼接;(3)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成该读框提前终止。只编码N-端氨基酸的cDNA序列而不完整;(4)只有编码c一端氨基酸序列的cDNA而不完整;(5)只是正确基因0RF中间的一段编码蛋白cDNA序列而不完整,缺N-端与C-端氨基酸序列,并且将不完整蛋白氨基酸序列的第一个非起始码氨基酸错误地预测为起始码氨基酸,如将L错误地预测为M;(6)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成前面出现不该有的终止码,因而编码蛋白缺开头部分氨基酸;(7)可能将污染基因组序列当作完整基因cDNA序列对待而预测出所谓单一外显子基因。即便真是基因,也只是较长单一外显子mRNA中有一小0RF,而0RF起始码上游同一相位确实存在终止码,无其他特点符合基因条件;(8)所预测基因只有0RF,而0RF两端没有任何EST证据,可据此0RF拼接出受EST和人类基因组双重支持的完整基因cDNA(开放读框上游同一相位有终止码),预示所预测0RF参考序列可能不正确;(9)有EST实验证据支持存在基因的人类基因组序列范围内又被预测出一条相似但更小的蛋白编码基因,因而新预测基因有可能是错误的。     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。     

大鼠肝癌演进中凝血因子V的可变剪接

为得到未知差异表达基因EST-5全长及探讨其在SD大鼠肝癌演进中的作用,采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),扩增5'端和3'端序列,PCR产物TA克隆后测序,BLAST检索分析所得序列.结果显示,该序列与挪威大鼠coagulation factor...     

白皮黄瓜鲨烯合酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

为认识葫芦科植物中葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因结构特征,克隆白皮黄瓜鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因c DNA并进行生物信息学分析。根据葫芦科植物绞股蓝、罗汉果、红花栝楼等的鲨烯合酶基因cDNA序列,设计白皮黄瓜鲨烯合酶引物,分别采用3'RACE和5'RACE技术扩增鲨烯合酶基因3'端和5'端。获得白皮黄瓜鲨烯合酶基因的两个cDNA克隆,命名为CsSS1和CsSS2,其cDNA序列全长分别为1 627 bp和1 534 bp,都编码417个氨基酸残基,分子质量为47.6 k D。成功克隆得到白皮黄瓜鲨烯合酶基因全长cDNA序列并对其进行序列分析,后续可用于葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因正选择位点功能分析。     

梅花类黄酮3'-羟化酶基因片段基于基因组DNA的简并PCR法克隆

用本研究设计的"预先去杂-SDS法"从梅花嫩叶提取到高质量的基因组DNA.根据11条已公开发表的并提交到GenBank的类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的假定氨基酸序列的保守区设计2个正向简并引物和3个反向简并引物组成6对引物,仅有1对引物能以PCR法同时从梅花'南京红须'、'南京红'和'粉皮宫粉'的基因组DNA扩增到一个469 bp的核苷酸片段,这3个片段在总体上有99.72%的一致性,与11条类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的相应区域有65.57%的一致性.同时,"GGEK"并非类黄酮3'-羟化酶的特征性模体.这是首次从木本植物的基因组DNA克隆到类黄酮3'-羟化酶基因片段.本研究结果可为梅花类黄酮3'-羟化酶基因全长的克隆奠定基础.     

cDNA捕捉法获得水稻杂种不育基因座位Sc区域的编码序列

摘要：cDNA捕获法足一种以表达为基础的基因分离技术,直接用目的区域的基因DNA捕捉该区域编码的cDNA,快速从大的基因组区域分离表达序列。本研究用一个水稻杂种不育基因座位Sc附近的大片段TAC基因组片段来捕捉该区域在水稻穗部表达的cDNA,共获得了6条不同的cDNA。将这些cDNA克隆进行测序分析,获得了该区域在水稻部表达的部分基因,其中1个是籼稻特有的基因。这些cDNA片段可成为新的标记用于目的基因的精细定位和候选基因序列分析。     

运用重叠延伸PCR技术构建在甘丙肽全长cDNA嵌入第二内含子的重构分子

构建嵌入第二内含子的甘丙肽(Galanin,GAL)全长基因组cDNA的重构分子。通过RT-PCR扩增出cDNA编区的序列,分别从基因组中扩增出cDNA的5′和3′端部分非编码序列;使用重叠延伸PCR(overlap extention PCR,OE-PCR)方法将三个片段重叠获得全长cDNA序列;再将全长cDNA从第三外显子第15个碱基处分成两部分,分开的cDNA前半部分和后半部分以及第二内含子进行重叠延伸获得重构分子,含有第二内含子的甘丙肽(GAL)全长基因组cDNA;将重构分子连入pMDI9-Tsimple载体。电泳分析观察到清晰的重构分子片段;测序显示重构分子由所设计的序列组成,第二内含子插入的位置准确,且无移码。使用重叠延伸PCR能够成功在cDNA中插入内含子获得一段重构基因。     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.     

金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株———金龟子绿僵菌CQMa102NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTLcDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102NTL基因cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102NTL的完整基因。为了解该基因的上游调控信息,采用PanhandlePolymeraseChainReactionAmplification方法扩增其上游序列。序列分析表明,CQMa102NTL全长DNA3484bp,cDNA全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝。Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612。     

水稻杂种与亲本间差异表达cDNA片段S600的分离克隆

采用cDNA-AFLP技术分离克隆了水稻杂种与亲本间差异表达基因片段S600。Northern杂交结果表明:在分蘖期和始穗期,S600在杂种和父本中表达丰度均较高,而在母本中表达丰度相对较低。S600在分蘖期和始穗期表达量不同,暗示了该基因的表达还受到发育时期的调节。同源搜索结果表明S600片段是水稻SBPase的部分编码序列。为了获得完整编码序列,以S600序列检索粳稻日本晴cDNA数据库,获得了两个高度同源(99%)且功能未知的全长cDNA克隆(AK062089和AK065773)。序列分析表明它们均包含一个相同的1179bp的开放阅读框,编码392个氨基酸组成的水稻SBPase前体,其中包含有与底物结合、氧化还原调节有关的保守氨基酸残基。检索发现该基因在水稻日本晴基因组中只有单个座位。