亚硒酸钠抗红细胞膜蛋白交联作用的机理探讨

邻苯二酚氧化处理人红细胞膜会导致膜蛋白交联,产生高分子聚合物(HMP)。用N—乙基马来酰胺(NEM)封闭膜蛋白硫基,则不产生HMP。预先用Na SeO_3(0.05mol/L)处理红细胞膜,也同样不产生HMP。用N—(3-芘)马来酰胺(N-〔3-P〕NEM)标记红细胞膜来测试不同浓度Na_2SeO_3对荧光强度的影响。结果表明,随着Na SeO_3浓度增高荧光强度相应降低。Na_2SeO_3对红细胞膜的预处理时间和荧光强度的变化有关。经Na SeO_3处理的红细胞膜ESR谱提示了Na_2SeO_3与材相互作用有关。用荧光法测定膜结合硒含量表明,Na_2SeO_3处理红细胞膜可导致膜结合硒含量增高。推测,Na SeO_3很可能与膜蛋白疏基作用形成结合硒,从而起到抗膜蛋白交联作用。     

硒与巯基作用稳定红细胞膜骨架

Na_2SeO_3可以减少人红细胞膜血影收缩蛋白(Spectrin)从膜骨架上解离下来.当含有巯基的二硫苏糖醇(DTT)存在下或红细胞膜用碘代乙酰胺(IAA)封闭巯基后.Na_2SeO_3的效应就不再呈现.用与巯基结合的荧光探针:N-[3-芘]-马来酰胺(N-[3-P]-M)来测试不同浓度Na_2SeO_3存在下红细胞膜的荧光强度.结果表明,随着Na_2SeO_3浓度增加,荧光强度就相应降低,这都说明硒是通过与红细胞膜巯基相作用来发挥效应的.~(31)P-NMR测试表明,人红细胞膜在加硒条件下透析,化学位移各向异性(Δσ)值低于不加硒的样品,这提示硒与红细胞膜蛋白巯基作用后红细胞膜脂-蛋白质的相互作用发生了变化.根据实验结果对硒作用后可能引起膜蛋白构象的变化也进行了讨论.     

竹红菌甲素引起红细胞膜蛋白的光敏交联

为了探讨竹红菌甲素对红细胞膜蛋白的光敏交联机理,我们使用了一些专一性及非专一性的基团修饰剂来修饰膜蛋白,试图说明膜蛋白的光敏交联究竟是由膜蛋白的巯基光氧化所引起的,还是膜蛋白的氨基酸与其侧链氨基之间的交联所引起的。我们分别采用N-乙基顺丁烯二酰抱亚胺(NEM)修饰膜蛋白的巯基,用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)来修饰色氨酸残基,用乙氧甲酸酐(DEP)修饰组氨酸残基,及用琥珀酸酐(SA)修饰氨基。测定了红细胞膜修饰前后及有竹红菌甲素存在时,光照前后的膜蛋白巯基及膜氨基的变化,膜蛋白内源性荧光的变化,以及对膜蛋白形成交联的影响。结果表明:NEM、DEP和NBS修饰的膜, 在有甲素存在时,光照对巯基影响很小,而对SA修饰的膜有明显的光敏作用。甲素对膜蛋白氨基的影响小于巯基,仅降低含量20%。甲素光照能引起NEM和SA修饰的膜内源荧光下降。甲素对NEM处理的膜仍能引起交联,但SA处理过的膜能抗交联,说明氨基在膜蛋白光敏交联中起着重要的作用。     

硒与红细胞血影收缩蛋白(Spectrin)作用导致构象变化

从人红细胞膜提取血影收缩蛋白(Spectrin),研究不同浓度Na_2SeO_3与其作用后的构象变化.用N—[3—芘]—马来酰胺(N-[3-P]M)作荧光探针标记Spectrin,经SDS处理后,其荧光强度随硒的浓度增加而逐步降低.但未经SDS处理的样品,加入0.2—1.0ppm的Na_2SeO_3后反而使荧光强度有所增加.Spectrin经硒作用与未经作用相比较在色氨酸内源荧光、丹磺酰氯(DNS-Cl)标记后(DNS-Spectrin)的荧光光谱以及色氨酸残基与DNS基团间的能量转移实验结果均有明显的差别.这反映Spectrin的巯基经与硒作用后会导致构象的变化.     

Na_2SeO_3对血影收缩蛋白(spectrin)与肌动蛋白(actin)相互作用的影响

Na_2SeO_3不影响肌动蛋白(actin)的聚合,但它可通过与血影收缩蛋白(spectrin)作用而间接促进actin的聚合。Na_2SeO_3的作用具有浓度依赖性:低浓度(0.5-5.0ppm)可提高actin聚合过程的成核速度及延伸速度,高浓度则产生相反的效应。巯基试剂如N-乙基马来酰亚胺(NEM)可消除硒的效应。因此,推测适量的硒可能导致spectrin构象发生一定变化,增强spectrin与actin的结合,降低actin链解聚的倾向性,从而稳定红细胞膜骨架。     

Na_2SeO_3对血影收缩蛋白(spectrin)与肌动蛋白(actin)相互作用的影响

Na_2SeO_3不影响肌动蛋白(actin)的聚合,但它可通过与血影收缩蛋白(spectrin)作用而间接促进actin的聚合。Na_2SeO_3的作用具有浓度依赖性:低浓度(0.5-5.0ppm)可提高actin聚合过程的成核速度及延伸速度,高浓度则产生相反的效应。巯基试剂如N-乙基马来酰亚胺(NEM)可消除硒的效应。因此,推测适量的硒可能导致spectrin构象发生一定变化,增强spectrin与actin的结合,降低actin链解聚的倾向性,从而稳定红细胞膜骨架。     

细胞内、外源活性氧致人多形核白细胞膜理化特性改变的研究

DPH和N-(3芘)马来酰亚胺标记光敏氧化反应及黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应生成外源性单线态氧(O_2)和超氧阴离子自由基(O_2)作用人多形核白细胞膜脂及膜蛋白质、荧光激发发射光谱形状、峰位未发生改变,荧光强度减小,其中以N-(3芘)马来酰亚胺标记O_2作用的膜蛋白质更为明显.荧光偏振度增大,相应清除剂L-组氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶有抑制效应.调理的酵母多糖刺激中性粒细胞呼吸爆发产生膜、胞内活性氧损伤膜脂、膜蛋白质,测定荧光参数变化与前者不尽相同,DPH荧先强度显著增加,L-组氨酸,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶似无抑制效果.     

巯基物质在氧自由基损伤离体胃粘膜细胞中的作用

本文用离体胃粘膜细胞研究了细胞内流基物质在活性氧诱发细胞损伤中的作用。实验采用pronase-EDTA法分离大鼠胃粘膜细胞并进行短期孵育,以黄嘌呤氧化酶(XO)-黄嘌呤(X)系统产生氧自由基损伤细胞。实验结果表明,用XO-X损伤胃粘膜细胞时,细胞存活率显著降低,乳酸脱氨酶(LDH)漏出量增多,同时细胞内非蛋白质巯基(NPSH)和蛋白质巯基(PSH)含量均不同程度地下降;N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)在耗竭细胞内NPSH和PSH的同时,引起细胞死亡和LDH漏出增加,这一作用与NEM的作用时间和浓度是显著依从关系;在细胞孵育液中预先加入含-SH的化合物还原型谷胱甘肽(GSH)或半胱胺,可剂量依赖性地减轻XO-X引起的细胞损伤。上述结果提示,胃粘膜细胞内的巯基物质在自身防御机制中具有重要作用,氧自由基损伤胃粘膜细胞的机制之一可能与破坏细胞内巯基的稳态有夫。     

荧光染料R-藻红蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体

以R-藻红蛋白(R-PE)标记小鼠抗人CD4单克隆抗体,形成单色或和用其他荧光染料标记的CD系列单抗组成双色、多色的荧光试剂,应用于流式细胞仪检测分析。用异双功能交联试剂SPDP和SMCC分别活化R-PE和CD4单抗,用DTT使经SPDP活化后的R-PE巯基化,再与用SMCC活化的CD4单抗交联。使用NEM终止交联反应,经Sephacryl S-300柱在AKTA FPLC快速液相色谱系统(简称AKTA)监测下分离纯化。结果用R-PE标记的抗CD4单抗,检测正常人外周血淋巴细胞表面CD4抗原的表达,经流式细胞仪(简称FACS)分析表明,R-PE标记的CD4抗体特异性保持完好,荧光强度较高,还可与用FITC标记的其它CD系列单抗配伍成双标或多标试剂。使用SPDP,SMCC异双功能交联试剂和DTT还原剂,成功地偶联了R-藻红蛋白和CD4单克隆抗体,可应用于流式细胞仪检测分析。     

肾性贫血红细胞膜蛋白巯基结合位置性质的ESR研究

用四种不同链长的马来酰亚胺氮氧自由基标记物研究了慢性肾衰竭(CRF)贫血病人红细胞膜蛋白巯基结合位置的性质。从所得的ESR波谱计算了弱、强固定化成分之比(W/S)。结果表明,由M(Ⅰ)、M(Ⅱ)和M(Ⅲ)标记病人红细胞膜所得的W/S值都比标记正常人红细胞膜得到的W/S位高(P<0.05),这说明慢性肾衰竭贫血病人红细胞膜蛋白的巯基结合位置的构象发生了变化;用M(Ⅳ)标记正常人红细胞和病人红细胞所得到的ESR波谱都只含有弱固定化波谱,没有强固定化波谱。得出的这个结果将为探讨CRF贫血的发病机理提供理论证据。     

硒对红细胞膜稳定作用的浓度依赖性

 Na_2SeO_3对人红细胞膜骨架具有稳定作用,但这种作用依赖于Na_2SeO_3的浓度。在低离子强度下,4℃透析人红细胞膜,实验组加入不同浓度的Na_2SeO_3,对照组不加Na_2SeO_3。结果表明,0.1—0.8ppm Na_2SeO_3的存在比对照组具有较高的Na~+,K~+-ATP酶活性、膜脂流动性。用N-[3-芘]-马来酰胺作探针,反映两者构象也有差异。如果在透析液中加入较高浓度的Na_2SeO_3(>1.0ppm)则会产生与低浓度相反的结果。人红细胞膜~31P-NMR的测试也表明,加入0.4ppm与4.0ppm Na_2SeO_3会产生不同的结果。与对照组相比较,低浓度使化学位移各向异性值(△σ)下降,而高浓度则使△σ增加。     

钒对人红细胞膜蛋白和膜脂质过氧化的影响

对钒酸根Ｖ（Ｖ）与红细胞膜相互作用研究表明Ｖ（Ｖ）使膜蛋白内源荧光淬火和膜巯基含量降低,但对膜脂质过氧化影响较小,提示Ｖ（Ｖ）主要与膜蛋白作用,与Ｖ（Ｖ）不同,Ｖ（Ⅳ）与红细胞膜的作用虽使膜蛋白巯基含量下降,但不显,其主要作用是引起膜脂质过氧化。     

膜蛋白巯基的氧化还原修饰对红细胞膜粘弹特性的影响

以正常人红细胞为样本,用巯基反应试剂对膜蛋白巯基进行氧化－还原修饰;用微管吸吮技术和生化分析,研究红细胞膜粘弹特性与膜蛋白巯基间的相关性。结果表明：在二酰胺（ｄｉａｍｉｄｅ）氧化修饰下,膜蛋白巯基含量降低,膜弹性膜量μ和粘性系数η均增加,而且随二酰胺浓度增加,它们的变化程度越大;在巯基乙醇还原修饰下,膜蛋白巯基含量增加,而弹性膜量μ和粘性系数η都降低;膜蛋白巯基含量与膜粘弹性系数μ和η呈负线性相关。根据实验结果,本文就引起红细胞膜粘弹特性变化的膜基团反应机制,进行了初步的分析和讨论     

汞化合物对红细胞膜作用的研究

本文研究了汞化合物对红细胞膜作用的光谱变化,观察了膜蛋白的荧光和磷光,膜上DPH的荧光偏振和ANS与红细胞膜的结合,以及他们与汞产生红血球溶血的关系。 在5P7.5缓冲液中红细胞膜蛋白的荧光随HgCl_2 Hg(AC)_2和PCMB的浓度加大而降低,表现为快和慢双相变化的过程,其淬灭作用的大小为HgCl_2>Hg(AC)_2PCMB,这是由于膜上形成了不发荧光的R—Trp—Hg~ 络合物以及能量从Trp转移到R—S—Hg~ 络合物上。HgCl_2对膜蛋白磷光的作用也是随汞离子浓度加大而降低,但磷光/荧光比则是增加的。标记红细胞膜的DPH偏振度是随HgCl_2浓度增加,表明膜流动性是随汞离子浓度加大而降低。标记膜上的ANS的荧光强度随HgCl_2和Hg(AC)_2的浓度加大而增加,这是由于ANS与膜的结合数随汞离子浓度加大而增加的缘故。上述各种变化是与汞离子对红血球溶血的作用一致的。     

条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针制备条件优化

通过化学方法使条斑紫菜R-藻红蛋白与抗体进行交联以制备荧光探针, 并对制备条件进行优化。首先采用异双功能试剂SPDP (N-琥珀酰亚氨基-3-2-吡啶基二硫丙酸醇)和DTT（二硫苏糖醇）分别使 R-PE(R-藻红蛋白)衍生化、IgG（单克隆抗体）巯基化, 其次测定了SPDP与R-PE不同摩尔比对R-PE衍生化的影响、DTT与IgG不同摩尔比对IgG巯基化的影响, 结果表明：SPDP与R-PE的最佳摩尔比为40：1, DTT与IgG的最佳摩尔比为500:1。在此基础上, 建立了R-PE与IgG交联的制备技术, 并应用全波长扫描吸收光谱、电泳分析和荧光显微镜观察等监测和分析技术, 证实了藻红蛋白与抗体已成功交联形成了复合物。     

肌动蛋白在丝瓜花粉管顶端生长中的作用

用非固定荧光标记的鬼笔环肽作为肌动蛋白探针观察并证明了丝瓜未萌发的花粉粒和不同生长时期花粉管中肌动蛋白纤丝的分布及其形态变化。又用细胞松弛素B（CB）、氯两嗪（CPZ）及N-乙酰马来酰胺（NEM）证明了丝瓜花粉管伸长与肌动蛋白既有密切的关系,也受Ca2 的调节。     

大强度训练及恢复后大鼠红细胞变形能力和红细胞膜蛋白的变化

目的 :探讨运动对红细胞变形性和红细胞膜蛋白的影响及其相互关系。方法 :设计不同强度的训练方案 ,用激光衍射法测定红细胞变形能力 ,用SDS PAGE方法测定一定体积大鼠红细胞膜中的重要蛋白带 3蛋白 (band 3)和肌动蛋白 (actin)的含量 ,研究运动即刻和恢复后红细胞变形性及膜蛋白的变化。结果 :长期的运动训练会促进大鼠红细胞变形能力的改善和红细胞膜band 3蛋白和actin的良好发展 ,一次大强度训练会引起红细胞膜band 3蛋白和actin含量的减少 ,大鼠红细胞变形能力降低 ,一周和二周的大强度训练会提高恢复期大鼠红细胞的变形能力和红细胞膜band 3蛋白和actin含量。结论 :运动训练造成的红细胞膜蛋白含量的变化 ,导致了红细胞膜结构的改变 ,从而影响红细胞变形能力 ,可能是训练对红细胞变形能力的作用机制之一。     

HXO体系对红细胞膜蛋白巯基修饰及膜粘弹性的影响

应用黄嘌呤氧化酶（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ＸａｎｔｈｉｎｅＯｘｉｄａｓｅＨＸＯ）氧自由基体系和微管吸吮方法（ＭｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅＡｓｐｉｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄ）,研究氧自由基对红细胞膜蛋白巯基氧化损伤,引起膜蛋白组成的变化,导致膜粘弹性参数膜弹性模量μ和粘性系数η发生变化。实验结果表明：（１）随着氧化酶浓度的增加,膜蛋白巯基的含量下降,膜蛋白交联形成高分子量组分（ＨＭＢ）;（２）膜弹性模量μ和粘性系数η随膜蛋白巯基含量的下降而上升;（３）膜蛋白巯基含量与膜弹性模量μ和粘性系数η间有显著的定量相关性。分析探讨了引起红细胞膜力学特性变化的膜蛋白巯基基团反应机制。     

胎盘膜胰岛素受体结合活性与巯基和二硫键的关系

部分纯化的人胎盘膜经DTT还原,NEM,DTNB修饰蛋白巯基后,改变了胰岛素受体的结合活性。Scatchard分析表明,当DTT浓度较低时,亲和常数基本不变;高亲和位点数略微升高,较高浓度的DTT处理时,结合位点数和亲和常数均有所下降。DTT还原膜蛋白二硫键后再用NEM,DTNB修饰巯基,胰岛素结合活性进一步下降。NEM或DTNB单独处理结合活性下降较少。胰岛素与受体结合后,用DTT洗后剩余的结合胰岛素比缓冲液洗低,表明有一部分胰岛素以二硫键与受体共价结合。在0—5mmol/L浓度范围内,随着DTT处理浓度的升高,这种以二硫键共价结合胰岛素增加。     

萎缩性肌强直(MYD)患者红细胞膜生物物理特性的研究

作者用荧光方法测定了MYD患者红细胞和正常人红细胞在不同细胞外液K~+浓度下的膜电位,结果MYD患者红细胞膜电位比正常人高;荧光偏振法研究结果表明,MYD患者红细胞膜流动性比正常人高;细胞电泳方法发现MYD患者红细胞电泳迁移率亦较正常人高.这些生物物理特性的改变是相互联系的、反映了MYD患者红细胞膜结构的变化并将直接影响膜的代谢和功能.