水稻细胞质1,6-二磷酸果糖酶基因1 195 bp的上游调控序列的克隆及其在转基因水稻中的表达研究

1,6-二磷酸果糖酶(EC3.13.11)催化1,6-二磷酸果糖分解为6-磷酸葡萄糖和无机磷酸.在高等植物的光合作用细胞中,存在两种1,6-二磷酸果糖酶:即叶绿体型1,6-二磷酸果糖酶和细胞质型1,6-二磷酸果糖酶.由于细胞质型1,6-二磷酸果糖酶在植物碳水化合物代谢中起重要作用,且具有表达特异性,本试验通过Genome Walking分离了水稻细胞质型1,6-二磷酸果糖酶基因的上游序列,并将其与β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因构建成嵌合表达载体.采用基因枪法转化水稻,在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.组织化学检测表明,在转基因水稻的成熟叶片中,GUS基因只在叶肉细胞中表达,在表皮细胞、泡状细胞、维管组织中均无表达;在叶鞘中的表达与叶片中相似,仅仅在叶肉细胞中表达;在根、茎所有细胞中均没有蓝色反应.为进一步研究1,6-二磷酸果糖酶基因启动子在水稻中的表达量,对12株独立来源的转基因水稻的GUS 活性进行了荧光定量分析.结果显示,水稻成熟叶片中的GUS活性平均值为7 031.5 pmol 4-MU-1*min-1*mg蛋白.在不同器官及组织中表达活性有差异,在转基因水稻的叶片、叶鞘中GUS均有较强的表达,在根、茎中未检测到GUS活性.实验结果表明,ATG上游1 195 bp调控区足以导致GUS基因在水稻中的特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式调控元件.     

从水稻细胞质型果糖-1,6-二磷酸酶启动子上游中去除93 bp可以彻底改变其表达模式

细胞质型果糖-1,6-二磷酸基因ATG上游1 195bp侧翼序列可调控GUS基因在水稻(Oryza sativa L.)中特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式元件.为了研究其调控特异表达的顺式元件,对启动子5′端进行了一系列的缺失,得到4种与GUS基因融合的植物表达载体,通过基因枪法转入水稻.结果表明,自启动子5′端-1 195 bp缺失至-1 102 bp时,GUS基因由叶肉细胞特异性表达变为组成型表达,且表达活性有所提高,推测在该区段中存在调控叶肉细胞特异性表达的顺式元件.进一步缺失仍然保持组成性表达的模式,即在转化株的根、茎和叶中的所有细胞中均有表达,同时启动子活性有所提高.这一结果暗示该启动子具有很大的应用潜力.     

从水稻细胞质型果糖—1，6—二磷酸酶启动子上游中去除93bp可以彻底改变其表达模式

细胞质型果糖_1,6_二磷酸基因ATG上游 1195bp侧翼序列可调控GUS基因在水稻 (OryzasativaL .)中特异性表达 ,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式元件。为了研究其调控特异表达的顺式元件 ,对启动子 5′端进行了一系列的缺失 ,得到 4种与GUS基因融合的植物表达载体 ,通过基因枪法转入水稻。结果表明 ,自启动子 5′端 - 1195bp缺失至 - 110 2bp时 ,GUS基因由叶肉细胞特异性表达变为组成型表达 ,且表达活性有所提高 ,推测在该区段中存在调控叶肉细胞特异性表达的顺式元件。进一步缺失仍然保持组成性表达的模式 ,即在转化株的根、茎和叶中的所有细胞中均有表达 ,同时启动子活性有所提高。这一结果暗示该启动子具有很大的应用潜力。     

水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达

为将不同启动子用于转基因水稻的研究,从武运粳8号水稻中克隆了Rubisco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区,构建了由rbcS启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞中特异性高效表达,而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织与细胞特异性.结果还表明,光诱导处理可明显提高rbcS启动子启动的外源基因的表达量.     

丙糖磷酸异构酶、果糖—1，6—二磷酸醛缩酶及果糖—1，6—二磷酸酶的共表达

致力于建立一条控制或降低大气中CO2浓度的途径,选择对 进行代谢工程以便改进其光合固定CO2的效率。作为研究的初始阶段,将编码丙糖磷酸异构酶、果糖－1,6－二磷酸醛缩酶及果糖－1,6－二磷酸酶的3个基因构建进一个由启动子trc控制的表达质粒pTrcFAT,成功地在大肠杆菌中实现了上述3个基因的活性共表达。活性测定结果显示：从1L培养液获得的破菌上清液每分钟可以催化二羟丙酮磷酸（DHAP）转化成700μmol果糖－6－磷酸。在此基础上进一步构建了这3个基因共表达的大肠杆菌－蓝藻穿梭表达质粒,也在大肠杆菌中实现了活性表达,当外泊基因的操纵子与载体质粒以大于1：1的比例进行构建时,可显著提高外源基因的表达量及相应的的酶活性。     

AtSTP3启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异表达研究

利用PCR技术从哥伦比亚型拟南芥基因组DNA中分离了AtSTP3绿色组织特异表达的启动子,序列分析表明,扩增片段(1774bp)与已报道序列的相应区域同源性达99.9%。将其与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并由农杆菌介导法导入水稻品种‘中花11’中。对转基因水稻植株中的GUS活性进行定性与定量测定结果表明,AtSTP3启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中特异性表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,AtSTP3启动子表现出明显的组织特异性。     

根癌农杆菌介导的转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

利用转基因植物作为生物反应器可以表达重组蛋白、生产外源蛋白质,也可以成为动物疫苗的廉价生产系统。以编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的基因为外源基因,以玉米泛素蛋白(Ubi)启动子为启动子,以潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因作为选择标记基因,β-半乳糖苷酸酶(GUS)基因作为报告基因构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV,并通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株。通过PCR分析和GUS活性检测,证实含有NDV-F基因的T-DNA已整合到水稻核基因组中,为研制廉价安全的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。     

转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

以编码新城疫病毒融合蛋白(NDV—F)基因为外源基因,与玉米泛素蛋白(Ubi)启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子构建成嵌合基因,构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV;并以潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因作选择标记基因、β-半乳糖苷酸酶(GUS)基因作报告基因,借助于农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株。PCR分析和GUS活性检测结果证实含有NDV—F基冈的T—DNA已整合到水稻基因组中,为研制廉价的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。     

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。     

参与水稻光合作用的PsbR3基因启动子的功能分析

本实验旨在研究水稻光合作用蛋白中各基因的表达模式. 采用RT-PCR和定量real-time PCR数据分析水稻不同组织的mRNA表达水平.结果显示,PsaK和PsbR3基因仅在茎、叶等绿色组织表达,而胚、胚乳部分均不表达.通过其启动子克隆、植物表达载体构建,以及农杆菌介导转化后,GUS组织染化分析和GUS荧光定量分析表明,两启动子均为组织特异性优势表达,PsbR3启动报告酶GUS在叶片中的表达活性为Actin启动子的3.29倍,而PsaK启动报告酶GUS在叶片中的表达活性低于Actin启动子的.这些初步结果提示,PsbR3启动子决定水稻绿色组织茎叶的优势表达,PsbR3基因可能参与水稻光合作用.     

利用根癌农杆菌法获得转基因水稻植株及其后代

在100μmol／L乙酰丁香酮（AS）等vir基因诱导分子存在的情况下,用含双元载体pBYT2的根癌农杆菌菌株EHA101同水稻（OrizasativaL．）台北309悬浮培养细胞共培养3天。经过2个月的连续筛选,共从364颗同根癌农杆菌共培养的悬浮培养细胞团中得到17个具有稳定潮霉素抗性和GUS表达的愈伤组织。对从8个转化组织中得到的10株可能的R0代转基因植株及其后代进行外源基因的整合和表达分析,Southern分析表明外源基因已稳定地整合进水稻基因组中并实现了有性遗传传递。杂交结果显示在其中一个转化系的植株中有5个拷贝的T－DNA整合,而其余的转化系则只整合了1个拷贝。转基因水稻细胞及植株中GUS活性的组织化学染色观察和荧光分析表明玉米ubiquitin基因启动子在水稻细胞中能高效启动gus报告基因的表达。ndPAGE－X－Gluc法检测表明转基因水稻细胞中表达的GUS蛋白比Sigma公司的标准GUS蛋白（SigmaCo．G0786）要小,而与来自大肠杆菌HB101（pBI1121）中的GUS蛋白大小相同。结果表明,根癌农杆菌可有效且可靠地介导外源基因转化水稻。     

拟南芥AtcpSecA基因表达的特异性

前期研究表明AtcpSecA基因的突变使叶绿体发育缺陷,内部缺少正常类囊体片层结构,叶片呈黄白色。在此基础上我们进一步研究AtcpSecA基因的表达特异性,并构建了AtcpSecA基因启动子与报告基因GUS的融合基因AtcpSecA：：GUS,以农杆菌介导方法转化获得转基因拟南芥。GUS组织化学染色结果表明,在AtcpSecA：：GUS转基因拟南芥的下胚轴、子叶、叶片、果柄等绿色组织中有很强的GUS活性,而在根、花序和种荚等非绿色组织中几乎没有GUS活性。降低培养基中琼脂浓度转基因拟南芥中AtcpSecA：：GUS基因的表达明显受抑制,暗中则显著受到促进。     

用无启动子的GUS报告基因捕获水稻基因启动子

构建了嵌合质粒p13DGUTs,它是在Ds转座子中插入了无启动子的B．葡萄糖醛酸酶报告基因(GUS),用于分离水稻基因启动子。将p13DGUTs转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,获得了496个转基因植株。抗性愈伤组织与转基因植株的GUS染色与PCR分析表明整合在水稻染色体上的Ds因子都发生了随机跳跃。转基因植株T0代与部分T1代的GUS染色结果表明,M92转基因植株中Ds转座子整合位置上游的水稻基因启动子指导GUS基因的表达及表达的特性是可遗传的。文章对此方法在分离水稻基因启动子与基因上的应用进行了讨论。     

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中EST丰度,从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Os772和Os359,并将启动子片段与GUS报告基因融合,构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经GUS组织化学分析显示,Os772和Os359能启动GUS基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Os772和Os359为两个水稻胚乳特异性启动子。     

水稻Xa21基因启动子序列分析及其在不同条件下的表达特征

以水稻品种‘日本晴’(Oryza sativa‘Nipponbare’)为实验材料,根据GenBank上公布的同品种水稻的基因组DNA序列设计1对引物,对水稻Xa21基因启动子进行克隆并测序,通过PCR扩增获得的Xa21基因启动子序列长1 982 bp,其中除包含启动子基本元件外,还包含一些与逆境信号相关的元件(GCC-box、A-box、TC-rich repeats、MBS、LTR和W-box等)。利用GUS组织化学染色和定量分析方法,研究了转基因水稻T1代株系不同器官和发育阶段Xa21基因启动子的表达特异性及其在不同逆境和激素处理条件下的表达特征,结果显示:在转基因水稻的叶、茎和根部均能检测到GUS活性,但根部GUS活性最高,特别是在根尖的中柱区活性最强;随苗龄增长(3叶期、5叶期和8至9叶期)叶片中GUS活性逐渐增加,8至9叶期GUS活性最高;机械损伤和100μmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理可使叶片中GUS活性显著或极显著提高,而干旱、500μmol.L-1水杨酸(SA)和100μmol.L-1脱落酸(ABA)处理则对叶片中GUS活性无明显影响。研究结果表明:外界逆境胁迫对水稻Xa21基因启动子的表达有诱导作用;该启动子的表达受水稻发育阶段的调控并具有一定的器官组织特异性,在根中的表达量最高;其介导的抗病反应依赖于茉莉酸(JA)信号通路。     

水稻OsCIPK10基因的克隆和功能分析

利用反向遗传学的方法对水稻OsCIPK10基因的功能进行了分析。结果表明,过量表达OsCIPK10基因的转基因水稻与野生型水稻在株型、抗高盐和耐低钾能力方面没有明显差异,但是小RNA干扰表达OsCIPK10基因的转基因水稻表现出显著的抗盐性。在缺钾胁迫条件下OsCIPK10基因的表达升高,推测该基因在应答高盐和低钾的非生物胁迫过程中起作用。OsCIPK10基因启动子与报告基因GUS融合表达的转基因水稻的染色结果显示:OsCIPK10基因呈组成型表达,但是在维管组织表达水平更高。     

水稻sbe1启动子驱动的反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究水稻基因启动子对外源基因在转基因水稻中表达的影响,构建了由sbe1启动子引导的反义sbe-GUS融合基因。经农杆菌介导,将不同的融合基因导入水稻中,定量测定转基因水稻植株不同组织中的GUS酶活力。结果表明,sbe1启动子可驱动反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻植株的胚乳中高效表达,而在颖壳、胚和茎叶等组织中的表达活性较弱。证实sbe1启动子在驱动外源基因的表达上表现有明显的组织特异性。     

外源糖对水稻Ugp1基因表达调控研究

植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）是蔗糖合成与降解途径的关键酶。本研究采用水稻叶片离体培养方法,结合Northern杂交技术,研究了外源糖对水稻Ugp1基因表达的影响。研究结果表明,蔗糖、葡萄糖、果糖、光照均能上调水稻Ugp1基因的表达,同时这种上调表达依赖于己糖激酶;果糖能上调水稻成熟叶片中Ugp1基因的表达,但并不影响苗期叶片中Ugp1基因的表达,具组织特异性;葡萄糖和果糖协同作用对Ugp1基因的诱导表达强于蔗糖,这种诱导除依赖于己糖激酶外,还存在其它未知的调控途径。水稻中存在UGPase的多种异构体,蔗糖及光照可诱导水稻Ugp1基因的上调表达,但对水稻UGPase的多种异构体形式并无影响。研究结果将有助于深入了解水稻Ugp1基因与糖信号途径互作调控网络。     

OsPIN1a基因在水稻植株不同组织表达与定位研究

目的:为了探讨水稻生长素极性运输输出载体蛋白OsPIN1a的在水稻不同组织的作用和分布。方法:以带有GFP和GUS标记的转OsPIN1a基因水稻和野生型中花11水稻为研究材料。通过PCR方法检测抗性标记基因潮霉素基因判断植株是否阳性;通过半定量RT-PCR方法分析OsPIN1a基因在转基因植株幼穗、叶片、根系的表达;通过GUS组织染色检测OsPIN1a在幼穗、叶片、根系中的活性;通过激光共聚焦显微镜观察OsPIN1a-GFP蛋白在根尖亚细胞定位情况。结果:实验所用的水稻株系均为转基因株系;RT-PCR检测发现,在根尖、叶片和幼穗中hpt和OsPIN1a基因均有表达;GUS组织染色结果表明,幼穗、叶片、根系均有GUS活性,其中在幼嫩的组织中表达量最大,如刚萌发种子胚芽鞘、花药和柱头;GUS活性受外源生长素诱导而受生长素极性运输抑制剂(TIBA)的抑制;激光共聚焦显微镜观察发现,OsPIN1a-GFP蛋白主要分布在根尖细胞膜上。结论:实验表明OsPIN1a基因参与了水稻各个器官和组织的发育,这些组织发育可能都受到生长素极性运输的调控。     

拟南芥色氨酸生物合成途径中PAI基因编码区5'端序列对基因表达的影响

将3个非等位PAI基因的启动子与其编码区5'端序列及GUS报告基因拼接成表达质粒,并转化拟南芥.GUS活性分析表明,PAI基因编码区5'端序列对维持PAI启动子所驱动的GUS活性是必须的, 有无该序列对GUS活性影响极大,在PAI1和PAI3中相差60～100倍, PAI2中相差1倍左右.GUS组织化学定位有相似结果,具5'端序列时,PAI启动子所驱动的GUS在植株的不同组织器官中有不同程度的表达,在叶片的叶肉细胞、保卫细胞中表达, 但在无叶绿体的表皮细胞中不表达.因此认为PAI基因的5'端片段所编码的多肽确有PTP的功能,PAI基因产物主要在质体(叶绿体)中表现出活性.